芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）仔稚鱼发育及CYP19A基因表达的影响

论文摘要

性别决定与分化是脊椎动物个体发育中两个重要过程。哺乳动物等高等脊椎动物的性别主要受自身遗传物质所决定,但在低等脊椎动物中,特别是鱼类中,其表型性别决定除受基因调控外,还受到其他多方面因素的影响。研究鱼类性别决定与分化的过程与规律,不仅可加深对鱼类系统进化的认识,也可为养殖鱼类单性化控制提供理论指导。鱼类单性化控制在水产养殖生产中占有重要的地位,通过该技术可以使某些鱼类单性化从而大幅度提高鱼的品质与产量。暗纹东方纯(Takifugu obscurus)俗称河纯,是一种经济价值较高的水产品。随着养殖业的发展,暗纹东方纯的研究内容已经涵盖了发育学、营养学、养殖学、遗传学等相关领域。在暗纹东方鲀的养殖过程中,人们发现雄性个体要比雌性个体具有更高的经济价值。因此找到一种可适用于养殖型暗纹东方纯的性别调控方法具有重要意义。本文在已有研究基础上,利用组织学切片及实时荧光定量PCR的研究方法,采用芳香化酶抑制剂(AI)——来曲唑,调节暗纹东方纯仔稚鱼的雌性激素合成与分泌,记录了AI对暗纹东方纯仔稚鱼生长发育、性别分化以及芳香化酶基因CYP19A表达的影响。希望可以获得CYP19A在性别分化中的作用机理,为暗纹东方纯单性化养殖提供参考,同时也为鱼类性别控制研究提供基础资料。对孵化后暗纹东方纯进行63d的AI暴露实验。测量生物体征指标,研究发现：正常河纯63d内的体长与时间呈线性关系,2dah时仔鱼平均全长达到3mm,至63dah时稚鱼全长己达到35.5mm,增长近12倍。正常组与时间暴露组相比,同一日龄河纯鱼,暴露组河纯鱼体重、体长要小于正常组,且有随着暴露起始时间越早、暴露时间越久,体重、体长值越小的趋势；与浓度暴露组相比,同一日龄河纯鱼,暴露组河纯鱼体重、体长要小于正常组,且有随着浓度越高,体重、体长值越小的趋势。研究还发现在不同浓度暴露下,63dah时河纯稚鱼体重与体长的相关性,即浓度暴露组河鲀鱼每增长单位体长所增加的体重要小于正常组,高浓度暴露组河鲀鱼每增长单位体长所增加的体重要小于低浓度暴露组。比较63dah时正常河纯与AI暴露河鲀性腺组织切片发现：正常鱼体性腺切片在200倍镜下已经可以观察到清晰的性腺结构,且卵巢与精巢结构明显不同。卵巢的特征表现为有卵巢腔,性腺体细胞位于卵巢被膜上皮层与生殖细胞之间,生殖细胞层形成褶皱状突起延伸至卵巢腔。精巢则为没有腔隙的实体结构,生殖细胞排列为一层位于精巢外缘紧挨上皮细胞。而在暴露组河纯中均未能找到形态正常的卵巢结构,除发育正常的精巢外,还发现一些异常性腺结构。这些异常性腺的共同特征是：生殖细胞排列散乱,位置不固定。其中一类疑似卵巢退化,能看到萎缩的腔隙,可能是在卵巢发育中受到抑制或是被其他性腺体细胞所填充。另一类疑似精巢,可以发现生殖细胞紧贴性腺上皮层,但并非均一的一层而是较为分散地位于整个性腺中,输精管原基也有部分缺失。AI对性别比产生显著影响。63dah时,7dah、10dah起始暴露组雌性比例为0%,10dah起始暴露组暴露时间最短抑制效果最好;0.625mg/L浓度组中已无雌鱼,规律表现为随着AI浓度升高雌性比例下降。用实时荧光定量PCR的方法检测了AI暴露后CYP19A的表达情况。研究表明：来曲唑对CYP19A基因的表达在河纯鱼中呈现二态表达性即高表达量A组和低表达量B组。在时间暴露的高表达量A组中,CYP19A基因的表达量均呈现出抑制作用。在42dah时,随着药物暴露起始时间的延迟,基因表达量变低,其中14dah起始暴露组基因表达量最低；在63dah时抑制规律与42dah时一致,基因表达最低同样出现在14dah起始暴露组,正常组及暴露组基因表达量都整体低于42dah时基因的表达量。低表达量B组中,42dah和63dah时CYP19A基因表达量未出现显著抑制效果,但63dah时正常组与暴露组基因整体表达量偏高于42dah。在浓度暴露的高表达A组中,来曲唑均对CYP19A基因表达产生抑制作用。但各暴露浓度组间抑制效果差别不大,63dah时抑制规律与42dah时基本一致。63dah时,正常组及暴露组基因表达量都低于42dah时。在低表达量B组中,42dah和63dah时CYP19A基因的表达量均未出现显著抑制效果,同一天的各浓度组间也没有显著差异。63dah时正常组与暴露组基因表达量偏高于42dah。综合实验分析,得到以下结论：①AI暴露可通过改变CYP19A基因的表达,影响暗纹东方纯仔稚鱼的性别分化,降低雌性比例。②暴露起始时间不同,雌性性别比例不同。10dah起始暴露组,雌性性别比例为0%,效果最好。③暴露浓度不同也会影响雌性性别比例,当浓度达到0.625mg/L时,雌性性别比例即可达到0%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 ：鱼类性别决定与分化及实验材料的研究综述
• 第一节 鱼类性腺决定与分化相关实验方法及基因的研究概况
• 第二节 芳香化酶抑制剂和暗纹东方纯的研究概况
• 第三节 本项研究的目的与意义
• 第二章 ：芳香化酶抑制剂对暗纹东方纯仔稚鱼生长发育及性别分化的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 ：芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀仔稚鱼CYP19A基因表达的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论与展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢