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鸭致病性肠炎沙门氏菌外膜蛋白组成及免疫原性研究

2020-12-03阅读(732)

鸭致病性肠炎沙门氏菌外膜蛋白组成及免疫原性研究

论文摘要

本研究围绕鸭致病性肠炎沙门氏菌外膜蛋白开展了以下研究:①鸭致病性肠炎沙门氏菌外膜蛋白超微结构观察和SDS-PAGE、免疫印迹分析;②将提取的外膜蛋白制成亚单位疫苗按一定剂量免疫雏鸭（OMPs 150μg）和小鼠（OMPs 30μg）,免疫后14d皮下注射肠炎沙门氏菌鸭0.2mL（4×109CFU/mL）活菌/只,小鼠0.2mL（1×107CFU/mL）活菌/只。观察7d,记录发病死亡情况,测定疫苗的保护率。③将提取的外膜蛋白制成亚单位疫苗按一定剂量（OMPs 150μg）免疫雏鸭,在免疫后的1d、7d、14d、21d、28d、35d、42d采抗凝血和凝血各一份。采用淋巴细胞增殖试验（MTT法）及间接ELISA分别对雏鸭的细胞免疫和体液免疫进行检测。④将提取的外膜蛋白制成佐剂苗按一定剂量（OMPs 30μg）免疫小鼠,全菌灭活佐剂苗0.2mL/只免疫小鼠,在免疫后1、4、7、10、14天采抗凝血和凝血分别用于淋巴细胞增殖试验（MTT法）及间接ELISA分别对小鼠的细胞免疫和体液免疫的检测。获得结果如下:1.超微结构:外膜蛋白负染后透射电镜下3万倍放大可以看到外膜蛋白呈双层泡膜状结构,形态主要呈C型。2.SDS-PAGE分析:9株菌的外膜蛋白电泳图非常相似,每个泳道上都含有主要4条主要的蛋白多肽,个别泳道上出现了5条或者6条蛋白带。其中36kD为9株菌所共有且含量最高,是主要蛋白。3.免疫印迹分析:9株菌的外膜蛋白经SDS-PAGE后进行免疫印迹试验,发现各菌株都有1条分子量为36kD的蛋白多肽与抗鸭肠炎沙门氏菌阳性血清发生免疫反应,呈现出阳性条带。4.外膜蛋白免疫攻毒保护实验:外膜蛋白亚单位疫苗免疫雏鸭能够抵抗致死量同源菌的攻击,保护率100%;而空白对照组则全部死亡,剖检具有典型病变。外膜蛋白佐剂苗和全菌灭活苗免疫小鼠后,可以抵抗致死量同源菌的攻击,外膜蛋白组保护率90%,灭活苗组保护率80%,对照组全部死亡。5.体液免疫和细胞免疫检测（1）外周血抗体IgG水平:雏鸭血清中特异性抗体OD值从免疫后第7d开始升高,第21d达到最大值（OD值达0.642）,以后开始下降,直到第42d OD值仍维持一定水平;从免疫后第7d始,直到第42d,免疫组抗体OD值均高于非免疫对照组差异极显著（P＜0.01）。小鼠免疫后经过间接ELISA检测可以看出,免疫组抗体OD值均高于非免疫对照组差异显著（P＜0.05）,全菌灭活苗组抗体OD值低于外膜蛋白苗组,但两种疫苗之间的差异不显著（P＞0.05）。（2）T淋巴细胞对ConA的反应能力:雏鸭免疫外膜蛋白后,从第14d开始外周血淋巴细胞对ConA的刺激有明显的反应,第21d时OD值达到最大值（0.500）,以后开始下降,第14-28d免疫组OD值均高于非免疫对照组异极显著（P＜0.01）。外膜蛋白免疫小鼠后外周血T淋巴细胞对ConA有明显的反应性,在第7d时,T淋巴细胞对ConA的反应能力就明显高于灭活苗组（P＜0.05）和空白对照组（P＜0.01）,第14d仍维持很高的水平。

论文目录

  • 本论文的创新性研究工作
  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 第一部分 文献综述及选题目的和意义
  • 第一章 沙门氏菌外膜蛋白研究进展
  • 1 肠炎沙门氏菌概况
  • 2 沙门氏菌外膜蛋白研究进展
  • 2.1 外膜蛋白的定义及组成
  • 2.2 各种外膜蛋白的功能及特性
  • 2.3 沙门氏菌外膜蛋白的基因调控
  • 2.4 沙门氏菌外膜蛋白的免疫学特性
  • 2.5 沙门氏菌外膜蛋白的同源性
  • 2.6 沙门菌外膜蛋白在实验诊断方法学方面的研究与应用
  • 3 选题目的和意义
  • 第二部分 试验研究
  • 第二章 鸭致病性肠炎沙门氏菌外膜蛋白的组成研究
  • 1 材料
  • 1.1 菌株
  • 1.2 主要试剂及配制
  • 1.2.1 外膜蛋白提取相关试剂
  • 1.2.2 SDS-PAGE电泳常用液体
  • 1.3 主要仪器及应用软件
  • 2 实验方法
  • 2.1 外膜蛋白的提取
  • 2.2 外膜蛋白浓度测定
  • 2.3 外膜蛋白形态的观察
  • 2.4 外膜蛋白的SDS-PAGE分析
  • 3 结果
  • 3.1 鸭肠炎沙门氏菌外膜蛋白的SDS-PAGE分析结果
  • 3.2 鸭肠炎沙门氏菌外膜蛋白的形态观察
  • 4 讨论
  • 4.1 外膜蛋白的提取
  • 4.2 鸭致病性肠炎沙门氏菌外膜蛋白的SDS-PAGE分析
  • 4.3 鸭致病性肠炎沙门氏菌外膜蛋白的形态
  • 第三章鸭致病性肠炎沙门氏菌外膜蛋白的免疫原性研究
  • 1 材料
  • 1.1 菌株
  • 1.2 实验动物
  • 1.3 主要试剂及配制
  • 1.4 主要仪器及应用软件
  • 1.5 其他材料
  • 1.6 主要溶液的配制
  • 1.6.1 免疫印迹相关试剂
  • 1.6.2 ELISA相关溶液
  • 1.6.3 MTT相关溶液
  • 2 实验方法
  • 2.1 兔抗鸭肠炎沙门氏菌抗体的制备
  • 2.2 Western Blotting检测兔抗体
  • 2.3 动物免疫试验
  • 2.3.1 雏鸭免疫试验
  • 2.3.2 小鼠免疫试验
  • 2.4 淋巴细胞转化实验
  • 2.5 ELISA检测免疫鸭血清效价
  • 2.5.1 抗原—抗体最佳浓度的选择
  • 2.5.2 ELISA方法的建立及对血清抗体效价的检测
  • 3. 试验结果
  • 3.1 鸭肠炎沙门氏菌外膜蛋白免疫印迹
  • 3.2 外膜蛋白免疫保护试验结果
  • 3.2.1 攻毒保护率
  • 3.2.2 外膜蛋白免疫鸭血清ELISA抗体效价的检测
  • 3.3 MTT法检测淋巴细胞
  • 4 讨论
  • 4.1 鸭致病性肠炎沙门氏菌外膜蛋白的免疫印迹
  • 4.2 鸭源肠炎沙门氏菌外膜蛋白的免疫保护性
  • 4.3 免疫外膜蛋白疫苗后血清抗体IgG的动态变化
  • 4.4 雏鸭免疫外膜蛋白疫苗后外周血T淋巴细胞转化效果
  • 第三部分 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文目录

    • 相关论文文献

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