论文摘要
目的:构建强力霉素可调控凋亡素基因表达的重组逆转录病毒载体,观察强力霉素调控下凋亡素基因的表达情况及其对人结肠癌细胞的致凋亡作用。 方法:将凋亡素基因克隆入逆转录病毒载体pRevTRE中,构建出重组载体pRevTRE-VP3。调节载体质粒pRevTet-on和反应载体质粒pRevTRE-VP3,分别经PT67细胞包装出有感染力但无复制能力的缺陷型病毒。两种病毒依次感染目的细胞Lovo,经抗生素持续筛选,获得双重稳定的抗性细胞株Lovo/on-VP3。向培养液中加入强力霉素启动凋亡素基因的表达,通过PCR、RT-PCR、荧光染色及流式细胞等技术,观察Lovo/on-VP3细胞中凋亡素基因的表达及细胞的凋亡变化情况。 结果:经酶切和测序鉴定,凋亡素基因被正确克隆到逆转录病毒载体pRevTRE-VP3中;PT67包装出的病毒滴度最高为:PT67/on-4—3×105cfu/ml;PT67/VP3-2—2×105cfu/ml;两种病毒依次感染Lovo细胞,最终筛选得到的双重稳定的细胞株Lovo/on-VP3-5,经PCR和RT-PCR证实凋亡素基因正确整合于细胞基因组DNA上,并得到了表达;流式细胞检测结果显示Lovo/on-VP3细胞在2mg/l Dox培养环境中,不同时间点的凋亡率明显高于无Dox环境中相同时间点的细胞凋亡率,两者差异有显著性。并且随着诱导时间的延长细胞凋亡率明显上升,与凋亡素表达的RT-PCR结果一致。 结论:1、利用RevTet-on系统成功地将凋亡素基因整合到了人结肠癌细胞Lovo的基因组中。 2、强力霉素可以有效地诱导调控凋亡素基因的表达。 3、凋亡素基因表达对人类结肠癌细胞Lovo有明显的致凋亡作用。
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