防治棉花黄萎病微生物有机肥的研制及其生物效应

论文摘要

棉花黄萎病是棉花产生连作障碍的主要病害之一,其病原菌为土壤习居菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb（Vd）,该病害的防治方法已成为棉花生产的研究热点。生物防治是目前研究克服土传病害的重要途径之一。本文从棉花黄萎病拮抗菌株的分离、筛选入手,从黄萎病重病棉田采集健康植株根际土壤中,通过平板对峙法,分离到600余株土壤细菌,并从中筛选到50余株具有拮抗能力的菌株,其中8株菌株均能显著抑制Vd生长,抑菌率大于70%;通过复筛,其中HJ-5,DF-15,DF-14三株菌株的抑菌率大于30%,并通过平板抗性试验表明三者之间无拮抗现象,所以选用HJ-5,DF-15,DF-14三株拮抗菌制备拮抗菌复合菌悬液进行盆栽试验。盆栽试验的结果表明,单独施用拮抗菌复合液或有机肥的处理干重差异显著,并显著高于CK,施用拮抗菌复合液与有机肥的混合物（微生物有机肥）处理的棉花株高、茎粗和干重显著高于CK,显著促进棉花苗期的生长。拮抗菌复合液和有机肥单独施用或共同施用对棉花苗期黄萎病均有防治效果,两者共同施用（即做成微生物有机肥）防治效果高达57%。从测定各处理间根际土壤微生物数量可以看出,拮抗菌复合液和有机肥单独施用或共同施用的处理真菌数量较CK都有减少,细菌和放线菌数量有显著增加,其中,细菌数量分别为CK的4.94～9.06倍、3.56～5.89倍、7.33～13.44倍;拮抗菌复合液或有机肥单独施用的处理放线菌数量较CK均有显著增加,分别为CK的2.44～4.81倍、3.15～5.89倍;两者共同施用的处理大丽轮枝菌菌核数量较单独接种病原菌处理下降34%。变性梯度凝胶电泳（DGGE）法研究棉花根际土壤微生物区系,结果表明,两者单独施用或共同施用后都能增加DGGE条带的数量;这表明土壤中加入拮抗菌复合液或有机肥后,提高了土壤微生物多样性。相似性分析说明两者单独施用或共同施用后都能促进土壤细菌特征性菌群的形成,改变土壤微生物群落结构特征。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 棉花黄萎病研究进展
• 1.1.1 棉花黄萎病的分类学地位和生物学特性
• 1.1.2 棉花黄萎病病原菌及其致病机理研究
• 1.2 植物病害生物防治研究现状
• 1.2.1 生防真菌的开发利用
• 1.2.2 生防细菌的开发利用
• 1.3 土壤微生物多样性的研究方法
• 1.4 细菌种群的现代鉴定技术
• 1.5 研究目的及技术路线
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 技术路线
• 第二章 棉花黄萎病拮抗细菌的分离、筛选
• 2.1 材料
• 2.1.1 土壤试验样本
• 2.1.2 供试病原菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 样品的采集
• 2.2.2 拮抗菌株的分离筛选
• 2.2.3 拮抗菌培养滤液对病原菌的抑制效果测定
• 2.2.4 数据处理
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 拮抗细菌的平板初筛结果
• 2.3.2 初筛菌株的培养滤液对Vd生长的影响
• 2.4 讨论
• 第三章 拮抗细菌HJ-5、DF-14和DF-15的鉴定
• 3.1 形态观察及生长条件的测定
• 3.1.1 形态观察
• 3.1.2 革兰氏染色
• 3.1.3 芽孢染色
• 3.1.4 生长周期测定
• 3.2 生理生化特征测定
• 3.2.1 淀粉水解
• 3.2.2 甲基红反应
• 3.2.3 明胶水解
• 3.2.4 柠檬酸盐利用试验
• 3.2.5 厌氧试验
• 3.2.6 氧化酶活性
• 3.2.7 硝酸盐还原试验
• 3.2.8 接触酶试验
• 3.2.9 卵磷脂酶活性
• 3.2.10 糖、醇类发酵试验
• 3.3 HJ-5、DF-14和DF-15菌株的16S RDNA序列的测定和鉴定
• 3.3.1 菌体总DNA的提取
• 3.3.2 HJ-5、DF-14和DF-15菌株16S rDNA的PCR扩增
• 3.3.3 PCR产物的T/A克隆
• 3.3.4 高效感受态细胞的制备和转化
• 3.3.5 质粒DNA的小量提取
• 3.3.6 质粒DNA的小量酶切
• 3.3.7 16S rDNA序列测定
• 3.3.8 拮抗菌株系统发育地位的确定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 形态观察与描述
• 3.4.2 生理生化特性的测定
• 3.4.3 温度对菌株HJ-5、DF-14和DF-15生长的影响
• 3.4.4 通气量对菌株HJ-5、DF-14和DF-15生长的影响
• 3.4.5 NaCl对菌株HJ-5、DF-14和DF-15生长的影响
• 3.4.6 菌株HJ-5、DF-14和DF-15生长中pH值的变化
• 3.4.7 HJ-5、DF-14和DF-15菌株的16S rDNA全序列测定及分析
• 3.5 讨论
• 第四章 拮抗菌株HJ-5、DF-14和DF-15对棉花苗期生长的影响
• 4.1 材料
• 4.1.1 拮抗菌复合菌悬液制备
• 4.1.2 病原菌抱子液制备
• 4.1.3 供试土壤
• 4.1.4 供试有机肥
• 4.1.5 供试棉花品种
• 4.1.6 盆栽试验方案
• 4.2 测定方法
• 4.2.1 植株地上高度测定
• 4.2.2 植株地上部分鲜重及干重
• 4.2.3 植株地下根鲜重及干重
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 拮抗菌和有机肥结合施用对棉花苗期生长的影响
• 4.3.2 拮抗菌和有机肥结合施用对棉花苗期黄萎病的防治效果
• 4.4 讨论
• 第五章 拮抗细菌和有机肥结合施用对棉花根际微生物数量的影响
• 5.1 材料
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 微生物数量的测定
• 5.2.2 PCR-DGGE
• 5.3 数据处理
• 5.4 结果与分析
• 5.5 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读硕士期间发表的论文