南美角蛙皮肤活性多肽资源发掘和南美角蛙镇痛肽结构与功能研究

论文摘要

两栖类的皮肤中含有种类繁多、功能复杂的生物活性物质,这些活性物质可用来抵御有害环境因子的侵袭。是有待于开发的宝库。目前,已从两栖类动物中分离鉴定出许多具有多种生物活性的蛋白及多肽。南美角蛙(Ceratophrys cranwelli),属于细趾蟾科角花蟾属,分布于阿根廷,玻利维亚,巴西大峡谷地带。其白化体也叫黄金角蛙,常被当成宠物饲养。本研究以南美角蛙为研究对象,通过生物化学、分子生物学等手段,对南美角蛙皮肤中活性多肽资源进行了研究,发现了南美角蛙皮肤镇痛肽并对其结构功能进行了研究。以来源于单个南美角蛙(Ceratophrys cranwelli)个体皮肤中提取的mRNA为材料,我们建立了南美角蛙皮肤cDNA文库,得到大约为1×106个独立的克隆。通过PCR的方法,以M13引物随机筛选插入片段在500～1000bp的克隆。共挑选了142个克隆并测序。测序结果通过NCBI数据库Blast,其中62条序列可以得同源性序列。其中11条为活性多肽的序列,例如半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin),溶菌酶(Lysozyme),性信息素(sodefrin)等等。南美角蛙中编码这些活性多肽的基因与亲缘性较近的非洲爪蟾中基因同源性较高,相似性最高可达76%,具有一定的特异性。活性多肽基因也具有多样性的特点。通过对南美角蛙皮肤cDNA文库的随机筛选,发现了一个具有氨基酸序列多拷贝现象的基因。经过翻译发现,在编码区内有6个拷贝,每个拷贝长19个氨基酸残基,并且每个拷贝的氨基酸序列都不完全相同,有一定的多样性。每个拷贝N端前两位氨基酸序列为KR,是两栖动物典型的翻译后加工位点。除去该位点,还有17个氨基酸。通过固相合成法合成了三条多肽,分别为CCAP1(TNGKGYQVENEDDYG DY)、CCAP2(TNGKDYQVENEDDYGDY)和CCAP3(TSGNGYQEENENDYGDY)。并进行了抗菌活性、抗氧化活性、缓激肽活性和镇痛活性检测。发现该类多肽具有镇痛活性,是一种镇痛肽。通过鼠尾光照镇痛实验发现,CCAP2(?)镇痛活性较强,其痛阈提高率达到40%1以上,且镇痛效果较为稳定,在60min内维持在一个较高的水平,具有潜在的临床应用价值。这是首次关于南美角蛙皮肤中活性多肽的报道。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略词对照表
• 第一章 ：文献综述
• 一. 南美角蛙简介
• 二. 两栖类皮肤中具有药物开发潜力的活性多肽研究概况
• 2.1 两栖类抗菌肽
• 2.2 两栖类缓激肽
• 2.3 两栖类镇痛肽
• 2.4 铃蟾肽及其相关肽
• 2.5 两栖类蛋白酶抑制剂
• 2.6 其他活性多肽
• 三. 两栖类动物药用资源的开发利用现状
• 第二章 南美角蛙皮肤cDNA文库构建和南美角蛙皮肤活性多肽的序列筛选
• 一. 前言
• 二. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 南美角蛙皮肤cDNA文库构建
• 2.3 南美角蛙皮肤cDNA文库中活性多肽序列筛选
• 三. 结果与分析
• 3.1 南美角蛙皮肤总RNA提取
• 3.2 南美角蛙皮肤cDNA文库的构建
• 3.3 南美角蛙皮肤cDNA文库筛选
• 四.结论与讨论
• 第三章 南美角蛙皮肤来源的镇痛肽分子克隆和活性检测
• 一. 前言
• 二. 材料
• 三. 方法
• 3.1 南美角蛙皮肤cDNA文库筛选
• 3.2 活性检测
• 四.结果与分析
• 4.1 南美角蛙皮肤cDNA文库筛选
• 4.2 活性检测
• 五.结论与讨论
• 参考文献
• 创新之处
• 附录
• 致谢