切花菊磷转运蛋白基因CmPT1的克隆和功能验证

论文摘要

切花菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）在世界切花市场上占有重要地位,是世界四大切花之一。磷素是切花菊生长发育的主要限制因素,磷缺乏最终会严重影响切花的质量和观赏品质。同时,磷肥作为一种不可再生的资源,其利用率却很低,超过90%的磷肥会很快转化为植物不能利用的状态。大量未被利用的磷素长期或暂时滞留在土壤中,不仅造成磷素资源的浪费,加剧土壤次生盐渍化,同时也加大了淋洗损失所造成的环境污染风险。因此,磷高效利用基因型发掘与新品种选育已成为作物育种的主要方向,本研究对切花菊磷转运蛋白基因进行克隆,为利用基因工程手段培育磷高效菊花品种奠定基础。主要研究结果如下:1.切花菊耐低磷品种的筛选利用砂培试验对32个切花菊品种进行了苗期耐低磷筛选和鉴定。结果表明,供试切花菊品种耐低磷能力存在明显的基因型差异,表现在幼苗相对干重（低磷胁迫/正常供磷）、相对磷含量和相对磷积累量存在较大的基因型间变异（变异系数CV分别为12.14%、20.99%和26.41%）,相对干重、相对磷含量和相对磷积累量之间均呈极显著正相关（P<0.01）。通过聚类分析可将32份供试品种的耐低磷胁迫能力分为极强、强、中等、弱、极弱5个级别,’南农银山’对低磷的忍耐能力最强,属耐低磷能力极强的品种;’南农红枫’、’南农香槟’和’优香’对低磷胁迫的忍耐能力最差,属耐低磷能力极弱的品种。2.切花菊磷转蛋白基因的克隆利用RT-PCR与RACE等技术从耐低磷切花菊品种’南农银山’中克隆得到一条磷转运蛋白基因全长cDNA,命名为CwPT1。序列分析显示,CmPT1全长1875bp,开放阅读框（ORF）为1596bp,编码532个氨基酸,跨膜结构预测分析表明该蛋白由12个亲脂的跨膜域（TM）组成。序列比对发现,CmPT1与已知的高亲和磷转运蛋白同源性达71.82%～78.85%。系统进化树分析表明,CmPT1和番茄磷转运蛋白LePT2的亲缘关系比较接近。CmPT1序列上存在Pht1家族磷转运蛋白保守特征序列GGDYPLSATIMSE,且位于第4个跨膜域,所以推测CmPT1属于Pht1家族磷转运蛋白成员。3。CmPT1的功能验证将CmPT1导入酵母PHO84缺失突变体MB192,结果表明,CmPT1能够与缺失磷转运功能的酵母突变体实现互补,并在低磷条件下促进酵母突变体对磷的吸收。使用放射性同位素32p测得CmPT1所编码蛋白在酵母中的Km值为35.2 μM,属于高亲和磷转运蛋白。4.CmPT1的表达模式通过实时定量PCR和半定量PCR分析发现GmPT1主要在根中表达,在茎中微弱表达,不在叶中表达,且在根部受低磷诱导,表达增强。5.超表达CmPT1提高转基因切花菊应对低磷胁迫能力低磷条件下,超表达CmPT1株系的株高、根体积、干重和总磷含量相对对照显著提高。CmPT1可能参与低磷信号传导,直接或间接参与低磷相关的根系形态建成,如根系伸长和侧根增多。综上,获得的CmPT1属于pht1家族的高亲和磷转运蛋白基因,负责菊花根部磷吸收和转运,且参与根形态建成,是切花菊磷营养信号网络的重要成员。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 磷素对植物的重要作用及缺磷对植物的危害
• 2 当前农业生产中磷利用现状
• 3 植物对低磷胁迫的适应机制
• 3.1 植物磷转运蛋白及其基因
• 3.2 植物磷代谢调控及信号
• 3.3 植物根系分泌物与磷营养
• 3.4 植物根际微生物与磷营养
• 3.5 植物根系形态性状与磷营养
• 4 提高植物磷营养水平的方法
• 4.1 选育磷高效利用植物品种
• 4.2 超表达磷转运蛋白改良植物磷营养
• 4.3 促进植物根系分泌有机酸活化土壤无效磷
• 4.4 促进植物根系分泌植酸酶和磷酸酶活化土壤有机磷
• 4.5 其他改良植物磷营养的方法
• 5 本研究的目的与意义
• 第二章 切花菊磷高效利用品种苗期筛选
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 筛选体系
• 1.2.2 试验处理
• 1.2.3 数据采集与分析
• 2 结果及分析
• 2.1 低磷胁迫下切花菊品种的生物学性状差异
• 2.2 筛选指标的建立
• 2.3 32个切花菊品种耐低磷特性的评价
• 3 讨论
• 第三章 切花菊CmPT基因的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.2.1 试剂及菌株
• 1.2.2 仪器设备
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 植物总RNA的提取
• 1.3.2 1st-Strand cDNA合成及检测
• 1.3.3 简并引物的设计
• 1.3.4 PCR扩增及电泳
• 1.3.5 目的片段的纯化回收
• 1.3.6 目的片段的连接
• 1.3.7 连接产物转化
• 1.3.8 重组子筛选与测序
• 1.3.9 3'RACE-PCR扩增
• 1.3.10 5'RACE-PCR扩增
• 1.3.11 cDNA全长序列的获得
• 1.3.12 基因序列的分析
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA提取质量与反转录效果检测
• 2.2 CmPT1基因的克隆
• 2.2.1 CmPT1基因中间保守片段的获得
• 2.2.2 CmPT1基因3'RACE结果
• 2.2.3 CmPT1基因5'RACE结果
• 2.2.4 CmPT1基因cDNA全长及ORF的获得
• 2.3 CmPT1基因及编码蛋白的生物信息学分析
• 2.3.1 CmPT1基因cDNA序列
• 2.3.2 CmPT1基因编码氨基酸疏水性分析和跨膜结构预测
• 2.3.3 CmPT1基因编码蛋白保守域比对结果
• 2.3.4 CmPT1氨基酸序列同源性比对
• 2.3.5 CmPT1系统进化树分析
• 3 讨论
• 第四章 CmPT1的功能验证与表达模式分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 仪器设备
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 酵母表达载体构建过程
• 1.3.2 酵母感受态细胞制备及其质粒转化
• 1.3.3 切花菊磷转运蛋白基因CmPT1在酵母中的功能验证
• 1.3.4 切花菊磷转运蛋白基因CmPT1的表达模式分析
• 2 结果与分析
• 2.1 重组质粒的双酶切验证结果
• 2.2 CmPT1在酵母异源体系中的功能验证
• 2.2.1 CmPT1能够恢复酵母缺失突变体在低磷环境下的生长
• 2.2.2 不同pH条件下各酵母菌株生长情况
• 2.2.3 磷吸收动力学的测定
• 2.3 CmPT1的表达模式分析
• 3 讨论
• 第五章 CmPT1超表达菊花的获得及表型分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 仪器设备
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 菊花遗传表达载体构建过程
• 1.3.2 农杆菌感受态的制备
• 1.3.3 冻融法转化农杆菌
• 1.3.4 Kan筛选浓度确定
• 1.3.5 农杆菌介导法转化切花菊'神马'
• 1.3.6 转基因抗性株系的分子检测
• 1.3.7 转基因超表达株系的表型分析
• 2 结果与分析
• 2.1 菊花遗传表达载体pBIG-CmPT1的双酶切验证
• 2.2 转基因抗性株系的获得
• 2.2.1 菊花叶盘不定芽分化和茎段生根阶段Kan筛选浓度的确定
• 2.2.2 获得转基因菊花再生植株
• 2.2.3 Kan溶液浸泡筛选浓度的确定
• 2.2.4 转基因菊花Kan溶液浸泡筛选和PCR验证
• 2.2.5 叶盘不定芽分化、茎段生根和叶片浸泡的筛选效果分析
• 2.3 转基因抗性株系的基因表达水平检测
• 2.4 '南农银山'和'神马'中CmPT1的序列比较
• 2.5 转基因超表达株系的表型分析
• 2.6 CmPT1是根部负责磷转运的高亲和磷转运蛋白基因
• 3 讨论
• 全文结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文、申请专利
• 致谢