补肾中药对大鼠骨髓基质干细胞增殖和分化的影响

论文摘要

研究目的干细胞研究对人类生命健康具有重大意义,组织工程研究的临床应用尚有许多问题有待解决,其中之一为种子细胞的来源问题。骨髓基质干细胞因其本身具有多向分化潜能和强大增殖能力而成为组织工程研究的主要种子细胞,本实验拟选择合适的骨髓基质干细胞体外分离和增殖的方法,以期建立一种较理想体外培养体系,为骨髓基质干细胞的临床应用提供理论依据和技术方法。骨髓基质干细胞的研究对于人们重新认识细胞的分离、增殖、分化也具有重大意义。本实验探讨补肾中药对骨髓基质干细胞增殖和分化的影响,发挥中医药的特长,把中医药与干细胞研究相结合,使两者相互促进,为干细胞的基础理论研究开辟一条具有中医特色的新思路,同时为补肾中药的作用机理和补肾法的临床应用提供微观的理论支持。本实验探讨中药含药血清的制备方法,为中药含药血清的制备提供理论和方法。观察单味补肾中药对骨髓基质干细胞增殖和成骨分化的影响,探讨补肾中药对骨科常见疾病治疗的基本机理。研究方法体外分离培养骨髓基质干细胞,观察细胞生长的特性,观测指标:细胞生长形态、MTT法分析细胞生长曲线。单味补肾中药的含药血清的制备。探讨动物的选择,灌胃的剂量,和灌胃的方案等。分析不同血清制备的方法对血清质量的影响,探讨最优化的含药血清制备方案。用补肾中药含药血清培养F2骨髓基质干细胞用天数作为横坐标,细胞数目作为纵坐标,用空白含药血清作对照,观察补肾中药对BMSCs增殖的影响。用补肾中药含药血清连续培养骨髓基质干细胞两代,用成骨诱导剂作阳性对照,观察补肾中药含药血清对骨髓基质干细胞向成骨方向分化的影响。实验结果骨髓基质干细胞体外培养具有良好的适应能力,用贴壁分离法,细胞能10～12d即可完成原代培养。F2代细胞生长迅速,以1:3传代后,4天即可铺满瓶底。形成均一性良好的单层细胞。用简单成熟的实验方法获得了淡黄色,无沉淀的中药含药血清。五种补肾中药的含药血清对BMSCs的增殖均产生了促进作用。设置成骨诱导剂的阳性对照组,通过ALP检测,培养两代以后,五种补肾中药都没有诱导骨髓基质干细胞向成骨方向分化。结论通过淫羊藿、巴戟天、杜仲、补骨脂、肉苁蓉五味补肾中药的含药血清制备,在体外培养的情况下,补肾中药对骨髓基质干细胞体外增殖均有不同程度的促进作用,对骨髓基质干细胞的成骨分化没有阳性结果,中医药临床使用补肾法治疗骨折,骨质疏松,骨性关节炎等疾病的主要机理是补肾中药对BMSCs的增殖有促进作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 骨髓基质干细胞的分离与培养
• 引言
• 1.1 研究目的
• 1.2 实验材料
• 1.2.1 实验动物
• 1.2.2 主要器械
• 1.2.3 主要仪器
• 1.2.4 主要试剂
• 1.2.5 主要试剂的配制
• 1.3 实验方法与步骤
• 1.3.1 BMSCs的分离与培养
• 1.3.2 倒置相差显微镜观察
• 1.3.3 BMSCs生长曲线分析
• 1.4 结果
• 1.4.1 倒置相差显微镜观察结果
• 1.4.2 MSC生长曲线分析结果
• 1.5 讨论
• 1.5.1 实验动物的选择
• 1.5.2 对于动物成长阶段的选择
• 1.5.3 灭菌
• 1.5.4 细胞的获取
• 1.5.5 分离BMSCs
• 1.5.6 消化传代
• 1.5.7 对血清和培养基的要求
• 1.5.8 BMSCs的提取和生长曲线分析
• 1.6 小结
• 第二部分 中药含药血清的制备
• 引言
• 2.1 研究目的
• 2.1.1 中药提取
• 2.1.2 灌胃方案
• 2.1.3 血清制备
• 2.2 研究材料
• 2.2.1 实验动物及药材
• 2.2.2 主要器械
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 主要试剂
• 2.2.5 主要试剂的配制
• 2.3 实验方法与步骤
• 2.3.1 中药汤剂的制备
• 2.3.2 灌胃
• 2.3.3 取血前的准备工作
• 2.3.4 取血
• 2.3.5 制备血清
• 2.3.6 操作注意内容
• 2.3.7 对制备过程中的血清质量进行观测记录
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 大鼠的麻醉情况
• 2.4.2 取血情况
• 2.4.3 离心管材料对血清析出的影响
• 2.4.4 血清质量
• 2.5 讨论
• 2.5.1 灌胃动物的选择
• 2.5.2 灌胃的时间
• 2.5.3 灌胃药量
• 2.5.4 血清的制备
• 2.6 小结
• 第三部分 中药血清对细胞增殖和向成骨方向分化的影响
• 引言
• 3.2 实验目的
• 3.3 实验材料
• 3.3.1 实验细胞
• 3.3.2 主要器械
• 3.3.3 主要仪器
• 3.3.4 主要试剂
• 3.3.5 主要试剂的配置
• 3.4 实验方法和步骤
• 3.4.1 单味补肾中药对细胞生长曲线的影响
• 3.4.2 ALP比活性测定
• 3.5 结果
• 3.5.1 单味补肾中药对细胞生长曲线的影响
• 3.5.2 ALP比活性测定结果
• 3.6 讨论
• 3.6.1 细胞分化的基本机制
• 3.6.2 影响分化的因素
• 3.6.3 体内、外细胞分化的差异
• 3.6.4 BMSCs分化的研究
• 3.6.5 单味补肾中药对BMSCs分化的影响
• 3.7 小结
• 结语
• 参考文献
• 综述一: 骨髓基质干细胞在骨科研究中的现状评述
• 综述二: 骨髓基质干细胞向骨和软骨的信号转导机制的研究进展
• 英文缩略词
• 发表论文情况
• 致谢