论文题目: Cathepsin B及其结合蛋白在卵巢癌细胞凋亡中的作用初步研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 刘建平
导师: 李育阳
关键词: 酵母双杂交,溶酶体,卵巢癌,细胞,细胞凋亡
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 细胞凋亡是多细胞生物清除剩余或受损伤的细胞，维持机体平衡，受基因调控的生理性过程。近几年的研究发现除经典的caspases蛋白酶外，位于溶酶体中的半胱氨酸蛋白酶cathepsins特别是cathepsin B(CTSB)也参与介导细胞凋亡过程。Cathepsins既可以与caspases协同作用也可以不依赖于caspases蛋白酶独立行使凋亡功能。但目前对于cathepsins在凋亡过程中的调控机制了解得很少。PP203是上海市肿瘤研究所通过大规模功能筛选获得的人类新基因，GenBank登入号AF258553。TSRC1也是一条功能未知的人类新基因，GenBank登入号BC027478。PP203 cDNA长2379bp，编码蛋白707aa，PP203蛋白具有一个BTB结构域和3个WD40结构域。TSRC1 cDNA长2071bp，编码蛋白424aa，TSRC1蛋白具有5个重复TSP1结构域。PP203和TSRC1基因的组织表达谱分析表明PP203基因在人卵巢、结肠组织无表达检出，在前列腺、睾丸和骨骼肌丰度较低，在其余的11种组织(心脏、脑、胎盘、肺、肝、肾、胰腺、脾脏、胸腺、小肠和白细胞)表达丰度较高。而TSRC1在所检测的16组织中除脑组织外表达丰度普遍较高。利用酵母双杂交技术，通过筛选人胎肝cDNA文库，获得与PP203作用的蛋白CTSB，与TSRC1作用的蛋白bikunin。CTSB是一种位于溶酶体内的半胱氨酸蛋白酶，bikunin则是一种Kunitz型蛋白酶抑制剂，在体外可以抑制胰蛋白酶、纤溶酶、颗粒细胞弹性蛋白酶等蛋白酶活性，但其体内生理性作用对象尚不知道。进一步研究发现TSRC1、bikunin也与CTSB结合。GST Pull-down和coimmunoprecipitation实验分别在体外和体内验证了CTSB与PP203、TSRC1、bikunin间的结合作用。荧光共聚焦显微镜分析显示CTSB分别与PP203、TSRC1和bikunin共定位于细胞浆的溶酶体，进一步证实了他们间的相互作用。PP203蛋白通过N端包含BTB结构域的区域与CTSB结合，bikunin蛋白则通过C端第二个KU结构域区段与CTSB作用。肿瘤坏死因子(TNF)是一种多效细胞因子，其中诱导凋亡的细胞毒性是其一项重要生物学功能。近期研究证实TNF可以诱导多种细胞溶酶体释放CTSB等cathepsins蛋白酶进入胞浆，激活细胞凋亡途径，导致细胞死亡。利用MTT法检测细胞的存活率，我们筛选了多种卵巢癌、前列腺癌和肝癌细胞株对TNF细胞毒性的敏感性，发现TNF和转录抑制剂放线菌素D合用可以有效地促进卵巢癌细胞OV-90、前列腺癌细胞PC-3和肝癌细胞SMMC-7721死亡，CTSB特异性抑制剂CA074Me和caspases蛋白酶广谱抑制剂zVAD-fmk能够有效地保护细胞免受TNF的细胞毒性作用。流式细胞仪检测(PI-FACS法)也证实CA074Me和zVAD-fmk可以抑制TNF诱导的OV-90细胞凋亡。利用AO-relocation和AO-uptake方法，我们发现在TNF诱导卵巢癌OV-90细胞凋亡过程中溶酶体结构发生破坏渗漏现象，CTSB特异性抑制剂CA074Me和caspases蛋白酶广谱抑制剂zVAD-fmk可以保护溶酶体结构稳定性；另外，荧光共聚焦显微镜分析也显示TNF介导OV-90细胞凋亡过程中，CTSB结合蛋白TSRC1从溶酶体转位至细胞浆中。上述结果说明TNF能够诱导卵巢癌细胞OV-90凋亡；在凋亡过程中溶酶体结构发生破坏，释放内容物进入细胞浆；CTSB蛋白酶参与OV-90细胞凋亡途径。本文进而研究了CTSB结合蛋白bilunin、TSRC1和PP203对TNF诱导的卵巢癌细胞OV-90凋亡的影响。Bikunin和PP203瞬时超量表达可以有效地抑制TNF诱发的OV-90细胞凋亡，TSRC1超量表达则促进OV-90细胞凋亡。对OV-90细胞内CTSB活性检测结果显示，bikunin超量表达可以抑制CTSB的蛋白酶活性，TSRC1和PP203超量表达对CTSB酶活无明显影响。推测bikunin很可能通过抑制CTSB的蛋白酶活性来阻断TNF诱导的OV-90细胞凋亡途径。CTSB在癌症发展中的两重性作用引起研究者关注，一方面很多癌症细胞出现CTSB异常高表达，分泌的CTSB促进癌细胞的转移，加剧癌症病情，另一方面溶酶体内的CTSB释放进入胞浆可以促进细胞凋亡，从而抑制癌症发展。本文的研究结果揭示CTSB参与介导卵巢癌OV-90细胞凋亡，CTSB结合蛋白bikunin、TSRC1和PP203对于该凋亡过程具有一定调节作用，为卵巢癌细胞凋亡机制的阐明和相关肿瘤治疗研究提供了一定的线索。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
缩写词表
引言
材料和方法
一、材料
二、方法
结果
1、PP203、TSRC1生物学信息和组织表达谱
2、酵母双杂交筛选与PP203、TSRC1相互作用的蛋白
3、CTSB与PP203、bikunin、TSRC1相互作用的验证
4、PP203、bikunin与cathepsinB作用区域分析
5、bikunin和CTSB分别作为bait蛋白进行第二轮酵母双杂交筛选
6、CTSB和溶酶体参与介导TNF诱导的卵巢癌等肿瘤细胞凋亡
7、PP203、bikunin、TSRC1对TNF诱导卵巢癌细胞凋亡的影响
讨论
全文总结
参考文献
综述
一、细胞凋亡中的重要蛋白酶caaspases
二、细胞凋亡信号传导途径
三、细胞凋亡的调控
四、TNF与细胞凋亡
五、溶酶体与细胞凋亡
参考文献
相关文章
致谢
发布时间: 2007-06-28
参考文献
- [1].miR-124通过靶向PDCD6抑制卵巢癌细胞及诱导凋亡机制的研究[D]. 袁犁.重庆医科大学2016
- [2].Claudin-6对卵巢癌细胞SKOV3生物学行为影响的研究[D]. 刘娇阳.南方医科大学2018
- [3].NANOG基因在卵巢癌细胞迁移、侵袭及耐药中的作用探讨[D]. 秦姗.河北医科大学2018
- [4].抑制miR-23a表达增强卵巢癌细胞顺铂敏感性的分子机制研究[D]. 金爱红.安徽医科大学2016
- [5].SOS1/EPS8/ABI1在卵巢癌细胞转移起始中的作用及其靶向短肽抑制剂抗转移活性的研究[D]. 余雪琛.武汉大学2015
- [6].茶黄素的UPLC分析及其对人卵巢癌细胞抑制作用和机制的研究[D]. 潘海波.浙江大学2018
- [7].Evi1表达对卵巢癌细胞生物学行为及化疗敏感性影响的初步研究[D]. 李霞.郑州大学2018
- [8].MARCH1促进上皮性卵巢癌恶性生物学行为及其机制的研究[D]. 孟莹.重庆医科大学2018
- [9].糖皮质激素对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制研究[D]. 王燕.第二军医大学2016
- [10].肿瘤干细胞靶向杀伤病毒表达系统对卵巢癌细胞生物学性状影响的研究[D]. 龙启芳.南京医科大学2017
相关论文
- [1].E-钙粘素介导的细胞黏附对卵巢癌细胞表皮生长因子受体（EGFR）的激活及其信号转导[D]. 刘联.山东大学2006
- [2].卵巢上皮性肿瘤中神经内分泌细胞的分布及部分作用研究[D]. 蒋立艳.暨南大学2006
- [3].E-cadherin与卵巢癌转移的相关性及机制研究[D]. 胡军.大连医科大学2007
- [4].雌激素受体亚型对卵巢癌增殖和侵袭的影响[D]. 朱静.复旦大学2006
- [5].雌、孕激素对卵巢上皮性癌细胞转移及其信号传导通路的影响[D]. 华克勤.复旦大学2006
- [6].Genistein对绒癌耐药细胞株JAR/MTX侵袭的影响及其机制的初步探讨[D]. 刘晓霞.复旦大学2005
- [7].上皮性卵巢癌中微卫星不稳定性和错配修复基因表达的研究[D]. 卢媛.复旦大学2006
- [8].糖原合酶激酶-3β对卵巢癌细胞增殖和化疗敏感性的影响及雌、孕激素对其调节作用[D]. 曹琦.复旦大学2006
- [9].可控性树突状细胞活疫苗诱导抗卵巢癌免疫应答的实验研究[D]. 康玉.复旦大学2006
- [10].组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究[D]. 王素梅.广西医科大学2008