论文摘要
采用硫酸铵梯度盐析法提取金手球、金晃、银世界、量天尺、金琥锦、黄金柱缀化6种仙人掌在不同饱和度硫酸铵下沉淀的蛋白质组分，并分别进行抑菌性试验，以筛选含具有抗菌效果的蛋白质组分的仙人掌品种。用Sephadex G75和Sephadex G25柱层析对抗菌效果最为显著的蛋白质组分作进一步分离纯化，并对纯化到的具有抗菌活性的多肽物质进行分子量、理化性质和抗菌活性检测，其主要研究结果如下：1．经过筛选发现，在6种被试品种中，有4种仙人掌含有具抗菌作用的蛋白质成分，主要沉淀于40％～80％硫酸铵饱和度盐析范围，部分大于80％，说明其蛋白分子量较小。其中以金手球（Mammillaria Haw.）所含蛋白质组分的抗菌效果最为显著。2．以灭活的金黄色葡萄球菌菌液作为诱导菌液，分别采用划伤自然诱导、蘸菌针刺诱导和划伤蘸菌涂抹诱导三种方法对金手球仙人掌植株进行诱导。诱导实验发现：诱导后的金手球组织周围有明显的抑菌圈出现，未诱导的组织未表现出明显抗菌活性。采用划伤蘸菌涂抹诱导的金手球植株所产生的抑菌效果最为明显，说明金手球组织中所含的抗菌物质不仅是可诱导的，而且还与诱导菌液的菌浓度有关，随诱导菌液的菌浓度的增大而增多。在诱导时间上，仙人掌组织诱导24h即可表现出明显的抑菌效果。采用比浊法进一步测试不同诱导方法和诱导时间仙人掌植株抗菌肽粗提物的杀菌效果发现：金手球仙人掌在诱导24h即产生大量的抗菌肽类物质，杀菌率显著提高；诱导72h杀菌率达最大。3．对金手球仙人掌的蛋白质粗提物进行分离纯化，得到分子量为8511Da、具有抗菌作用的小肽，命名为MH-AMP-1。在整个纯化过程中，用硫酸铵梯度盐析去除约55％的高分子量杂蛋白，纯化倍数为2.96。经Sephadex G75和Sephadex G25进一步分离纯化，最终使抗菌肽的比活性提高到376.81U.mg-1，回收率为5.52％。SDS-PAGE图谱显示所得纯化样品只呈现单一蛋白质电泳条带，表明已达到电泳纯。MH-AMP-1的茚三酮反应呈阳性，说明N端未封闭。4．对MH-AMP-1的热稳定性研究表明，在低于70℃水浴1h后，MH-AMP-1抗菌活性无明显变化；80℃～90℃水浴1h，抗菌活性略有下降，100℃水浴1h，抗菌活性仍保持在80％以上，说明MH-AMP-1具有较好的热稳定性。pH影响实验表明，MH-AMP-1在pH2.5～7.5都具有较强的抗菌活性，当缓冲液pH＞8时抗菌活性明显减弱，表现出阳离子抗菌肽特征。5．对MH-AMP-1的抗菌谱及最小抑菌浓度（MIC）值进行研究发现：MH-AMP-1对蜡样芽孢杆菌、化脓杆菌、白色念株菌、隐球酵母有较明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、绿脓杆菌有较强抗菌活性。说明MH-AMP-1对革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌及真菌均有一定的抑制作用，抗菌谱较广。MH-AMP-1对黄色葡萄球菌、枯草杆菌的MIC为30μg.mL-1，对蜡样芽孢杆菌、隐球酵母的MIC为60μg.mL-1，对白色念株菌的MIC为120μg.mL-1，表明其抗菌活性强。通过对抗菌肽的筛选、诱导、分离纯化等实验不仅从金手球仙人掌中分离得到了新的抗菌肽MH-AMP-1，其性质研究还表明仙人掌的抗菌消炎作用除与传统观念认为的化学成分有关，还与受基因编码调控的抗菌肽有关。