VEGF小干扰RNA抑制视网膜新生血管的研究

论文摘要

目的视网膜新生血管性疾病，如糖尿病性视网膜病变，缺血性视网膜静脉阻塞和早产儿视网膜病变等均会导致视网膜新生血管。血管内皮生长因子（Vascularendothelial growth factor VEGF）是视网膜新生血管形成最主要的生长因子。抑制VEGF的表达，可以减少视网膜新生血管的形成。本文采用RNA干扰技术，从分子水平抑制VEGF的表达。研究的目的是构建VEGFsiRNA的表达质粒，以小鼠氧诱导视网膜病变新生血管动物模型为研究对象，探讨VEGF小干扰RNA（VEGFsiRNA）对小鼠视网膜新生血管模型中视网膜新生血管的抑制作用，评价其治疗视网膜新生血管性疾病的效果。方法本研究包括4部分：1．分别设计针对猴和小鼠的VEGF小干扰RNA，以pSilencer2．1-U6neo为质粒载体，构建VEGFsiRNA表达质粒，转化大肠杆菌，酶切、测序鉴定。2．体外培养的猴视网膜微血管内皮细胞分成常氧组和二氯化钴缺氧组。缺氧组中，脂质体LipofectamineTM2000（LF2000）介导分别转染空载体质粒（空载体组）和VEGFsiRNA表达质粒（VEGFsiRNA转染组），缺氧组中未转染的细胞为缺氧对照组。常氧组细胞不做转染，为正常组。采用MTT法观察细胞增殖，real-timeRT-PCR检测VEGFmRNA的表达，Western blot检测VEGF蛋白的表达。3．改良的Smith方法建立氧诱导小鼠视网膜病变模型，采用HE染色、FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片观察视网膜新生血管的形态变化，real-timeRT-PCR检测视网膜中VEGFmRNA的动态表达。4．C57BL/6J小鼠分为四组。常规空气中饲养小鼠为正常组，氧诱导小鼠视网膜病变小鼠随机分为缺氧对照组、空载体组和基因治疗组，正常组和缺氧对照组小鼠不做处理，空载体组和基因治疗组分别以脂质体LipofectamineTM2000（LF2000）介导玻璃体腔内注射空载体质粒和VEGFsiRNA表达质粒。结果1．将合成的DNA序列退火后克隆到载体上，并做测序分析，经酶切和测序鉴定确定为所需序列。2．MTT法细胞转染24h、48h、72h生长曲线显示VEGFsiRNA质粒转染组细胞的生长速度较其他各组细胞生长速度减慢。real-time RT-PCR和Western blot显示细胞VEGFmRNA及蛋白水平：正常组细胞仅见弱的VEGFmRNA和蛋白表达，而缺氧对照组表达明显上调（P＜0．01），空载体转染组表达与缺氧对照组比较无显著性差异（P＞0．05），VEGFsiRNA转染组较缺氧对照组减弱（P＜0．01），VEGFmRNA和蛋白抑制率分别为48．07%、51．82%。3．氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管在P14开始出现，P17达高峰，以后逐渐下降。氧诱导视网膜病变中VEGFmRNA在P12表达较低，P14达高峰，以后逐渐下降。4．病理切片显示正常组很少见到突破视网膜内界膜的内皮细胞细胞核，而对照组和空载体组中则可见到大量突破视网膜内界膜的内皮细胞细胞核，发生率为100%，基因治疗组较缺氧对照组和空载体组明显减少。免疫荧光染色显示正常组VEGF呈弱阳性表达，对照组和空载体组VEGF表达呈强阳性，基因治疗组VEGF表达明显减少。real-time RT-PCR显示正常组视网膜VEGFmRNA中仅见弱的VEGFmRNA表达，而缺氧对照组表达上调（P＜0．01），空载体组表达与缺氧对照组比较无显著性差异（P＞0．05），基因治疗组较缺氧对照组减弱（P＜0．01），VEGFmRNA抑制率为43．39%。结论1．体外实验：脂质体介导VEGFsiRNA表达质粒能有效抑制猴视网膜微血管内皮细胞的生长速度及VEGFmRNA和蛋白的表达。2．体内实验：采用脂质体介导，玻璃体腔注射VEGFsiRNA表达质粒可有效抑制小鼠缺血性视网膜病变模型新生血管的形成。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、靶向干涉VEGFshRNA质粒载体的构建和验证
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、VEGF小干扰RNA抑制缺氧猴视网膜微血管内皮细胞VEGF的实验研究
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、氧诱导小鼠视网膜新生血管模型的建立及VEGF的动态表达
• 3.1 对象和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 四、VEGF小干扰RNA抑制鼠视网膜新生血管的实验研究
• 4.1 对象和方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• RNA干扰技术及其在眼科的应用
• 综述参考文献
• 致谢