嗜热厌氧梭菌乙醇耐受性改造及发酵低品位生物质产乙醇的特性研究

论文摘要

嗜热厌氧梭菌（Clostridium thermocellum）最适生长温度为55-60°C，最适pH为7左右。它能产生一种包含纤维素酶、木聚糖酶等组分的酶复合体——纤维小体（cellulosome），可以直接分解纤维素用于细胞生长并产生乙醇、乙酸、乳酸、氢气和二氧化碳等代谢产物。燃料乙醇的发展已经来到以木质纤维素为原料的时代，C.thermocellum能直接分解纤维素并生成乙醇和氢气两种新能源使其成为潜在的集成生物工艺（Consolidated Bio-processing, CBP）的菌株。C.thermocellum摇瓶培养只能利用约5g/L的纤维素或者纤维二糖，因为培养基pH随其生长产酸下降而抑制生长。此外C.thermocellum野生菌只能耐受1-2%的酒精，这大大限制了其工业应用。本研究采用外源酒精胁迫的方法通过61代的连续传代成功将C.thermocellum野生菌的酒精耐受性提高到5.0%。驯化菌在5g/L纤维素底物的摇瓶培养后，乙醇产量为1.23g/L，较野生菌提高了20.58%；以20g/L纤维素为底物进行反应器培养，驯化菌的乙醇产量在96h达到最高值为5.17g/L，相较野生菌提高了28.93%，说明驯化过程对于C.thermocellum的乙醇产量有明显的提高。木薯渣易发酸发臭污染环境，但其淀粉和纤维素含量丰富，是理想的低品位生物质原料。产纤维小体的C.thermocellum驯化菌和产淀粉酶与木聚糖酶的Thermoanaerobacterium aotearoenseΔldh二者共培养时表现出良好的协同作用，在55°C、150rpm共培养发酵木薯渣相较二者的单独培养能积累更多的可发酵糖，之后再降温到37°C接种酿酒酵母可在24h内利用完残糖并生成乙醇。C.thermocellum与T. aotearoense共培养，二者接种比例1:1，嗜热培养84h，底物浓度4%，厌氧方式接种6%的酵母为此两阶段共培养发酵的最佳条件，最终乙醇浓度为8.93g/L，发酵效率为64.95%，乙醇产率为0.081g/（L·h），氢气产量为4.06mM。此两阶段共培养的发酵方式不用外加酶且乙醇产量达到单独酶解发酵的水平，是一种新的CBP途径。C.thermocellum能直接发酵未经任何预处理的造纸污泥，在化学制浆污泥中其乙醇产量最高达到7.41g/L，纤维素酶活和木聚糖酶活最高分别达到1.92FPU/mL和1.30U/mL；在脱墨污泥里其发酵受到明显的抑制，乙醇产量只有1.31g/L，纤维素酶活和木聚糖酶活分别为1.64FPU/mL和0.90U/mL。C.thermocellum粗酶液纤维素酶最适温度为60°C，最适pH为5.5；木聚糖酶最适温度为70°C，最适pH为7.0，两种酶都表现出较广的金属离子适应性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 燃料乙醇
• 1.1.1 燃料乙醇的生产现状
• 1.1.2 燃料乙醇的生产工艺
• 1.1.3 燃料乙醇生产的菌种
• 1.1.4 燃料乙醇生产的主要原料
• 1.2 嗜热厌氧梭菌
• 1.2.1 嗜热厌氧梭菌产乙醇研究进展
• 1.2.2 嗜热厌氧梭菌纤维小体研究进展
• 1.2.3 产物抑制
• 1.2.4 梭菌产氢的研究
• 1.3 嗜热厌氧杆菌
• 1.4 本研究主要研究内容与意义
• 1.4.1 本研究主要内容
• 1.4.2 本研究主要研究意义
• 第二章 菌种乙醇耐受性驯化与发酵特性对比
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验菌株
• 2.2.2 仪器与试剂
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 实验方法
• 2.2.5 分析测定方法
• 2.3 计算
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 C.thermocellum 生长曲线的测定
• 2.4.2 C.thermocellum 基本生长特性的研究
• 2.4.3 C.thermocellum 乙醇耐受性驯化
• 2.4.4 代谢副产物对 C.thermocellum 野生菌和乙醇耐受菌株生长的影响
• 2.5 本章小结
• 第三章 两阶段混菌培养 CBP 途径利用木薯渣产乙醇与氢气的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验菌株
• 3.2.2 仪器与试剂
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 实验方法
• 3.2.5 分析测定方法
• 3.2.6 数据分析与处理方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 菌种的代谢途径分析
• 3.3.2 嗜热菌单独培养与共培养对乙醇浓度的影响
• 3.3.3 C.thermocellum 与 T. aotearoense 接种比例对乙醇产量的影响
• 3.3.4 酵母接种方式对乙醇产量的影响
• 3.3.5 嗜热发酵时间对乙醇产量的影响
• 3.3.6 底物浓度对乙醇浓度的影响
• 3.3.7 酵母接种量对乙醇发酵的影响
• 3.3.8 嗜热培养阶段产氢能力研究
• 3.3.9 CBP 途径综合分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 嗜热厌氧梭菌直接发酵造纸污泥特性与产酶研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验菌株
• 4.2.2 仪器与试剂
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 实验方法
• 4.2.5 分析与测定方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 不同浓度的纤维素和纤维二糖对菌种产酶的影响
• 4.3.2 C.thermocellum 生物反应器直接发酵不同造纸污泥的基本特性
• 4.3.3 C.thermocellum 粗酶液纤维素酶和木聚糖酶的基本特性
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附录