胆管癌中IDH突变的鉴定及该突变抑制ALKBH分子机制的研究

论文摘要

异柠檬酸脱氢酶基因/DH1和/DH2在多种癌症中发生突变,包括低级别神经胶质瘤、急性髓性白血病、软骨肉瘤和甲状腺癌等。我们通过对326例胆管癌样品进行测序发现,/DH1和/DH2在大约10%的肝内胆管细胞癌中发生突变,发生该突变的肿瘤表现为5-羟甲基胞嘧啶水平下降以及5-甲基胞嘧啶和组蛋白H3K79二甲基化水平上升。临床数据分析表明,发生IDH1/2突变的胆管癌病人有着更长的总生存期和术后复发时间。同时我们发现,IDH1/2突变可能导致一种引起p53通路激活的细胞应激状态。通过对肿瘤样品中基因组CpG甲基化的分析,我们发现了2309个高度甲基化的基因,高度甲基化位点主要分布在CpG岛旁和转录起始位点上游,表明这些甲基化修饰影响肿瘤中的基因转录。其中,有超过一半的高甲基化基因在神经胶质瘤中已有报导,说明在不同∞肿瘤中IDH1/2突变可能作用于相同的下游靶基因,从而诱导肿瘤发生。我们的前期研究结果表明,IDH1/2突变肿瘤中基因组DNA和组蛋白的高甲基化现象是由于突变的IDH1/2会催化生成2-羟基戊二酸（2-HG）,而2-HG可以作为α-酮戊二酸（α-KG）的类似物,竞争性的抑制依赖α-KG的双加氧酶,如TET家族DNA羟基化酶和JmjC家族组蛋白去甲基化酶。我们进一步的研究发现,2-HG还可以抑制另外一类名为ALKBH的α-KG依赖型双加氧酶,该酶参与DNA烷基化损伤的修复。我们发现,IDH1/2突变的神经胶质瘤中的DNA修复通路被激活；在神经胶质瘤细胞系U87MG中过量表达IDH1突变体会增加细胞对多种烷基化试剂和抗肿瘤药物的敏感性。我们的研究结果表明,IDH1/2突变除了可以导致表观遗传调控紊乱之外,也可能通过抑制DNA修复系统来促进肿瘤发生。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 肿瘤代谢的特点——Warburg现象
• 1.2 维持Warburg现象的遗传学基础——与代谢相关的基因突变
• 1.2.1 缺氧诱导因子（Hypoxia induced factor,HIF）
• 1.2.2 MyC
• 1.2.3 AMPK和LKB1
• 1.2.4 丙酮酸激酶PKM2
• 1.3 异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase,IDH）突变在肿瘤发生中的作用
• 1.3.1 IDH突变的发现
• 1.3.2 IDH突变导致肿瘤发生的分子机制
• 1.4 本研究的目的、主要内容和意义
• 参考文献
• 第二章 肝内胆管癌中IDH突变的鉴定和肿瘤基因组甲基化表型的研究
• 2.1 研究背景
• 2.1.1 胆管细胞癌简介
• 2.1.2 基因组DNA甲基化与肿瘤发生
• 2.1.3 IDH1/2突变与CIMP的关系
• 2.1.4 IDH1/2突变的特点
• 2.1.5 本研究的目的
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验试剂
• 2.2.2 肿瘤样品的收集和保存
• 2.2.3 从冷冻的肿瘤肿瘤组织中制备基因组DNA
• 2.2.4 从石蜡包埋的肿瘤组织切片中制备基因组DNA
• 2.2.5 从基因组中对IDH1/2的外显子进行PCR扩增和测序
• 2.2.6 免疫组化
• 2.2.7 全外显子测序
• 2.2.8 HumanMethylation450 BeadChip
• 2.2.9 临床病理学数据分析
• 2.2.10 差异CpG甲基化区域的统计分析
• 2.2.11 基因表达芯片数据分析
• 2.2.12 CpG甲基化位点的GSEA分析
• 2.2.13 从大肠杆菌中表达和纯化重组IDH1蛋白
• 2.3 结果
• 2.3.1 IDH1和IDH2在肝内胆管细胞癌中发生突变
• 2.3.2 IDH1和IDH2突变病人的病理学特点
• 2.3.3 胆管细胞癌中IDH1和IDH2突变抑制Tet家族羟基化酶和组蛋白去甲基化酶的活性
• 2.3.4 IDH1和IDH2突变与胆管细胞癌中p53通路失活相关
• 2.3.5 IDH1或IDH2突变导致胆管细胞癌基因组的高度甲基化
• 2.3.6 胆管细胞癌中IDH1和IDH2突变影响基因表达
• 2.3.7 IDH1或IDH2突变的胶质细胞瘤中甲基化水平存在差异区域的分析
• 2.3.8 IDH1/2突变的神经胶质瘤和胆管细胞癌中共同的高度甲基化区域分析
• 2.4 讨论
• 2.5 参考文献
• 第三章 IDH1突变抑制DNA修复酶ALKBH,从而增加细胞对烷基化抗癌药的敏感性
• 3.1 研究背景
• 3.1.1 IDH1/2突变与α-KG依赖的双加氧酶
• 3.1.2 AIkB家族DNA去甲基化酶
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 对神经胶质瘤的基因表达谱进行GSEA分析
• 3.2.3 RNA抽提
• 3.2.4 反转录和qPCR
• 3.2.5 细胞培养
• 3.2.6 细胞转染
• 3.2.7 免疫印迹（Western Blot）
• 3.2.8 定点突变实验
• 3.2.9 感受态细胞的制备
• 3.2.10 构建稳定表达IDH1的细胞株
• 3.2.11 ALKBH2和ALKBH3的体外酶活测定
• 3.2.12 细胞中代谢小分子的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 IDH1突变激活DNA损伤修复基因
• 3.3.2 D-2-HG抑制ALKBH2和ALKBH3的活性
• 3.3.3 IDH1突变体的过量表达的细胞对烷基化试剂的敏感性上升
• 3.3.4 IDH1突变体引起细胞对烷基化试剂敏感的现象依赖于突变体生成2. HG的酶活
• 3.3.5 IDH1突变细胞对临床烷基化抗癌药敏感性的研究
• 3.4 讨论
• 3.5 参考文献
• 发表文章
• 致谢