枳实中黄酮类化合物的提取、分离、鉴定与生物活性研究

论文摘要

本文以枳实中黄酮类化合物提取、分离纯化为目的,运用乙醇回流法为提取手段,实现黄酮类化合物的最大化利用。经过提取、分离、纯化得到七种黄酮化合物单体,借助RP—HPLC、ESI—MS、1D—,2D—NMR等现代仪器对黄酮类化合物进行了分析和结构鉴定。1.枳实粗提物中黄酮苷类化合物检测方法的确定运用RP—HPLC法,确立在岛津ODS柱(RP—18,5μm,250min×4.6)上,以①流动相:水:乙腈(v/v)=78%等梯度25min后,10min内水的体积转为10%并保留此梯度20min;②流速:0.8ml/min;③检测波长:280nm完成分析。该方法大大提高了黄酮苷类化合物检测的专属性和有效性,分析结果较为准确可靠。在该条件下,以LC/MS为检测方法,初步鉴定出粗提物中含有四种黄酮苷类化合物,并以此四种黄酮苷类化合物的提取率作为优化枳实中黄酮类化合物提取工艺的标准。2.枳实中黄酮苷类化合物提取工艺的确定研究了乙醇提取液浓度、提取时间、料液比对黄酮苷类化合物提取率的影响并确定提取次数,根据四种黄酮苷峰面积之和所占的百分比判断提取率的大小,确定适合大量提取的工艺。综合考虑提取和后期处理成本,以采用60%乙醇水溶液,回流提取1.5h,按照1:10的料液比,提取2—3次为宜。3.枳实中黄酮类化合物分离、纯化与鉴定分离纯化并鉴定了四种黄酮苷类化合物、三种多甲氧基黄酮化合物:芸香柚皮苷(narinrutin)、柚皮苷(naringin)、橙皮苷(hesperidin)、新橙皮苷(neohesperidin);桔皮晶(tangeretin)、蜜桔黄素(nobiletin)、4′,5,7,8—四甲氧基黄酮(4′,5,7,8—Tetramethoxyflavone)。其中桔皮晶,蜜桔黄素,4′,5,7,8—四甲氧基黄酮在此前与枳实相关的其他文献中未见报道,很可能是首次从该中药中分离得到的。4.枳实中多甲氧基黄酮的生物活性研究对桔皮晶、蜜桔黄素,4′,5,7,8—四甲氧基黄酮进行了抗肿瘤生物活性体外筛选试验,结果表明三种多甲氧基黄酮对人乳腺癌Bcap37细胞及人肝癌SMMC7721细胞具有一定的体外增殖抑制作用,其中桔皮晶对Bcap37细胞的抑制作用以及蜜桔黄素对SMMC7721细胞的抑制作用相对较强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 中药枳实的研究概况
• 1.1.1 枳实概况
• 1.1.2 枳实中主要有效成分研究概况
• 1.1.3 枳实药理研究概况
• 1.2 柑橘属黄酮类化合物的研究进展
• 1.2.1 黄酮类化合物
• 1.2.2 柑橘属黄酮类化合物的提取分离方法
• 1.2.2.1 乙醇或甲醇提取法
• 1.2.2.2 碱性水或碱性稀醇提取法
• 1.2.2.3 超声提取法
• 1.2.2.4 超临界流体萃取法
• 1.2.2.5 高速逆流色谱法
• 1.2.2.6 硅胶柱层析
• 1.2.2.7 大孔吸附树脂
• 1.2.2.8 酶法提取
• 1.2.3 柑橘属黄酮类化合物的鉴别检测方法
• 1.2.4 柑橘属黄酮类化合物的生理功能
• 1.2.5 柑橘属黄酮类化合物的实际应用
• 1.3 本课题研究的意义和内容
• 第2章 枳实中黄酮苷类化合物提取工艺的研究
• 前言
• 2.1 黄酮苷类化合物检测方法的确定
• 2.1.1 实验材料与仪器
• 2.1.1.1 实验材料
• 2.2.1.2 仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 样品的提取及制备
• 2.1.2.2 样品中黄酮苷类化合物的定性检测
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.3.1 HPLC初步定性检测黄酮苷类化合物
• 2.1.3.2 LC/MS初步鉴定黄酮类化合物
• 2.2 黄酮苷类化合物提取工艺的确定
• 2.2.1 实验材料与仪器
• 2.2.1.1 实验材料
• 2.2.1.2 仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 提取方法
• 2.2.2.2 检测方法
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.3.1 乙醇浓度的选择
• 2.2.3.2 提取时间的选择
• 2.2.3.3 料液比的选择
• 2.2.3.4 提取次数的选择
• 2.3 本章小结
• 第3章 枳实中黄酮类化合物分离与纯化
• 前言
• 3.1 黄酮类化合物的初步分离
• 3.1.1 实验材料与设备
• 3.1.1.1 实验材料
• 3.1.1.2 仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 大量提取
• 3.1.2.2 乙酸乙酯萃取
• 3.1.2.3 正丁醇萃取
• 3.1.3 结果与分析
• 3.2 四种黄酮苷类化合物的纯化
• 3.2.1 实验材料与设备
• 3.2.1.1 实验材料
• 3.2.1.2 仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 大孔树脂分离纯化组分B
• 1,B₂,B₃的RP—HPLC检测方法'>3.2.2.2 组分B₁,B₂,B₃的RP—HPLC检测方法
• 3.2.3 结果与分析
• 3.3 黄酮苷类化合物的制备
• 3.3.1 实验材料与设备
• 3.3.1.1 实验材料
• 3.3.1.2 仪器
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.2.1 分析条件
• 3.3.2.2 制备条件
• 3.3.3 结果与分析
• 3.3.3.1 分析型RP—HPLC上最佳条件的选择
• 3.3.3.2 黄酮苷类化合物的制备
• 3.4 多甲氧基黄酮类化合物的分离纯化
• 3.4.1 实验材料与设备
• 3.4.1.1 实验材料
• 3.4.1.2 仪器
• 3.4.2 实验方法
• 3.4.2.1 湿法装柱
• 3.4.2.2 干法上样
• 3.4.2.3 洗脱
• 3.4.3 结果与分析
• 3.5 本章小结
• 第4章 枳实中黄酮类化合物的结构鉴定
• 4.1 实验材料与设备
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 仪器
• 4.2 实验检测方法
• 4.2.1 RP—HPLC检测条件
• 4.2.2 LC/MS检测条件
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 化合物Ⅰ的结构鉴定
• 4.3.2 化合物Ⅱ的结构鉴定
• 4.3.3 化合物Ⅲ的结构鉴定
• 4.3.4 化合物Ⅳ的结构鉴定
• 4.3.5 化合物Ⅴ的结构鉴定
• 4.3.6 化合物Ⅵ的结构鉴定
• 4.3.7 化合物Ⅶ的结构鉴定
• 4.4 本章小节
• 第5章 多甲氧基黄酮类化合物的生物活性
• 5.1 实验材料与设备
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 仪器
• 5.2 实验检测方法
• 5.2.1 细胞株及培养条件
• 5.2.2 体外肿瘤细胞增殖抑制试验
• 5.3 结果与讨论
• 第6章 结论
• 参考文献
• 波谱附图
• 致谢