萝卜细胞质雄性不育胞质和核基因的分子标记的开发及其分子特征

论文摘要

萝卜（Raphanus sativus L．）是深受世界人民喜爱的根菜类蔬菜。萝卜的杂种优势非常显著，能够有效地提高产量和改善纤维品质。在植物中，细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）是一种不能产生正常功能花粉的母性遗传性状，被广泛地应用于商业化生产F1代杂种。萝卜CMS系的细胞质即能导致萝卜属植物雄性不育，又能导致芸薹属植物雄性不育，而且其CMS不易受环境条件和不同遗传背景的影响，从而是十字花科植物中最受关注的不育细胞质之一。目前已有一种萝卜CMS及其对应的恢复位点从萝卜导入到油菜中，但一些不良的农艺性状随着恢复基因的导入而出现。远期目标在于阐明萝卜CMS及育性恢复以及使萝卜CMS在十字花科杂种优势育种中得到充分利用。本篇论文中，我们就萝卜CMS胞质不育和核基因的分子标记及其分子特征进行了描述。取得的主要研究结果如下： 获得了一个萝卜CMS系统，该系统由雄性不育系9802A、保持系9802B和恢复系9802H组成。该不育系花药外观皱缩或正常，无可见花粉，而Ogu CMS系花药外观皱缩未完全发育；NWB CMS系则花药外观正常、花药内有部分花粉。不育系9802A和恢复系9802H杂交产生的F1植株全部表现雄性可育，表明CMS的恢复表现型是一种显性性状。获得了由300个单株组成的F2代育性分离群体。卡平方测验表明分离群体中可育与不育的分离比符合3∶1的比例，证明9802A雄性不育的育性恢复受单一显性基因控制。 用萝卜Ogu orf138基因的特异引物组合ORF-F和ORF-R，在萝卜CMS系9802A总DNA中扩增出了一条DNA片段，而在保持系9802B和恢复系9802H中未扩增出任何产物。序列分析表明该片段与特异诱导Ogu CMS相关基因orf138序列完全一致。该DNA片段可以作为选育萝卜CMS的分子标记。 合成了能够扩增出萝卜NWB CMS系的特异分子标记的引物组合NWB-F和NWB-R，该引物组合在萝卜CMS保持系9802B和恢复系9802H总DNA中扩增出了单一DNA片段，而在CMS系9802A总DNA中未扩增出任何产物。该DNA片段可以作为辅助选育萝卜CMS保持系的分子标记。 采用混合分群分析法和F2代的300个单株筛选了萝卜CMS恢复基因Rfw的RAPD标记。对100条RAPD引物的扩增产物进行筛选后，发现RAPD标记OPC06-1900与恢复基因Rfw连锁。通过分子克隆和核苷酸测序将该RAPD标记转换成了显性的SCAR标记SCC06-1894。BLAST搜索表明SCC06-1894与拟南芥和甘蓝硫酸盐转运蛋白基因的对应区域高度同源。设计了等位特异引物，扩增出了SCAR标记SCC06-415。用F2代的分离群体进行PCR分析及序列分析表明SCC06-1894和SCC06-415等位，与Rfw／rfw的遗传距离为8.0cM。根据一个萝卜

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 十字花科植物雄性不育及育性恢复研究进展
• 1.1 十字花科植物雄性不育的来源
• 1.1.1 天然雄性不育
• 1.1.2 杂交产生的雄性不育
• 1.1.3 原生质体融合获得雄性不育
• 1.1.4 基因工程获得雄性不育
• 1.2 植物雄性不育的遗传学说
• 1.2.1 三型学说
• 1.2.1.1 核质互作型
• 1.2.1.2 胞质型
• 1.2.1.3 核作用型
• 1.2.2 二型学说
• 1.2.3 变异基因假说
• 1.2.3.1 细胞质雄性不育
• 1.2.3.2 细胞核雄性不育
• 1.2.3.3 核质互作雄性不育
• 1.2.3.4 基因型-环境互作雄性不育
• 1.2.4 多种核质基因对应学说
• 1.3 十字花科植物雄性不育的遗传
• 1.3.1 细胞质雄性不育
• 1.3.2 细胞核雄性不育
• 1.3.2.1 显性细胞核雄性不育
• 1.3.2.2 隐性细胞核雄性不育
• 1.4 十字花科作物雄性不育的细胞学研究
• 1.5 十字花科作物雄性不育的生理生化研究
• 1.5.1 同工酶
• 1.5.2 物质代谢
• 1.5.3 植物激素
• 1.6 十字花科作物雄性不育的分子生物学研究
• 1.6.1 线粒体基因组与CMS
• 1.6.2 叶绿体基因组与细胞质雄性不育性
• 1.6.3 十字花科恢复基因对CMS相关基因的调控
• 1.6.4 十字花科植物CMS恢复基因的分子特征
• 1.6.5 人工创造雄性不育突变体研究
• 1.7 本研究的目的与内容
• 1.7.1 研究的目的
• 1.7.2 研究的内容
• 第二章 萝卜CMS系胞质不育相关基因及分子标记的鉴别
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 基因组DNA抽提
• 2.2.2.1 大量抽提法
• 2.2.2.2 DNA的浓度和质量检测
• 2.2.3 特异PCR引物合成
• 2.2.4 特异引物PCR扩增反应体系与程序
• 2.2.5 特异PCR片段的回收
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7 特异PCR片段的克隆
• 2.2.8 特异PCR片段的测序
• 2.2.9 序列分析软件
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 萝卜orf138基因在CMS系统中的表现
• 2.3.1.1 PCR扩增结果
• 2.3.1.2 PCR产物的克隆及测序
• 2.3.2 引物组合NWB-F／R扩增产物在CMS系统中的表现
• 2.3.2.1 PCR扩增结果
• 2.3.2.2 PCR产物的克隆及测序
• 2.4 小结
• 第三章 萝卜细胞质雄性不育核基因的PCR标记的开发及其特征
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 育性鉴定及取材
• 3.2.3 基因组DNA抽提
• 3.2.3.1 大量抽提法
• 3.2.3.2 小量抽提法
• 3.2.3.3 DNA的浓度和质量检测
• 3.2.4 总RNA的提取和快速检测（供返转录用）
• 3.2.5 RACEs
• 3.2.5.1 第一链返转录
• 3.2.5.2 5'和3' RACE
• 3.2.6 基因池的建立
• 3.2.7 RAPD-PCR分析
• 3.2.8 扩增产物的检测
• 3.2.9 遗传距离的计算
• 3.2.10 目的RAPD-PCR和特异PCR片段的回收克隆测序
• 3.2.11 序列信息分析软件
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 植株育性鉴定结果
• 3.3.2 RAPD分析结果
• 3.3.3 恢复基因Rfw连锁的SCAR标记的开发
• 3.3.4 SCAR标记SCC06-1894的序列分析
• 3.3.5 CMS核基因rfw连锁SCAR标记的开发
• 3.3.6 恢复基因Rfw连锁的PCR标记的开发
• 3.3.7 CMS恢复基因Rfw与Ogu CMS恢复基因Rfo的关系
• 3.3.8 CMS恢复系9802H中恢复基因Rfo cDNA信息的获得
• 3.3.9 Rfo-like基因的发现
• 3.3.10 Rfo基因与Rfo-like基因表达谱分析
• 3.4 小结
• 第四章 萝卜CMS恢复基因的连锁基因—硫酸盐转运蛋白基因的克隆及其特征
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 鉴定基因拷贝数的群体建立
• 4.2.1.2 供Northern杂交分析的植株处理方法
• 4.2.2 基因组DNA抽提及DNA的浓度和质量检测
• 4.2.3 RNA提取
• 4.2.3.1 异硫氰酸胍法抽提（Northern杂交用）
• 4.2.3.2 总RNA的提取和快速检测（供返转录用）
• 4.2.4 RACEs
• 4.2.5 Northern杂交分析（见附录A）
• 4.2.6 序列分析软件
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 CMS恢复系9802H中RSultr3.2A cDNA的克隆
• 4.3.2 RSultr3.2A cDNA的分子特征
• 4.3.3 RSultr3.2A基因组结构特征
• 4.3.4 RSultr3.2A在萝卜基因组中的拷贝数
• 4.3.5 缺硫对RSultr3.2A基因表达的影响
• 4.3.6 RSultr3.2A基因表达谱分析
• 4.3.7 cDNA RSultr3.2B的克隆及其分子特征
• 4.3.8 cDNA RSultr3.2B来源分析
• 4.4 小结
• 第五章 讨论
• 5.1 本实验CMS与NWB CMS和OGU CMS系统不育胞质之间的关系
• 5.2 萝卜CMS育性遗传研究
• 5.3 植物CMS恢复基因的分子标记
• 5.4 植物CMS恢复基因的克隆
• 5.5 萝卜CMS恢复基因的连锁基因
• 5.6 后续研究展望
• 参考文献
• 附录A NORTHERN杂交分析
• 附录B
• 附录C
• 附录D
• 附录E：发表论文
• 致谢