替米沙坦对骨桥蛋白在单侧输尿管结扎大鼠肾组织中表达的影响

论文摘要

目的:肾间质纤维化（Renal interstitinal fibrosis, RIF）是多种肾脏疾病进展的共同结局。研究发现在慢性肾脏疾病中肾小球滤过率减少与肾间质纤维化密切相关,在慢性肾脏病的进展过程中肾间质纤维化扮演着极为重要的角色。肾小管间质损害的特征是炎细胞浸润,而促进炎细胞的浸润的细胞因子尚未完全明了。巨噬细胞是炎症细胞,它的聚集程度与随后相应部位的纤维化程度密切相关,是启动肾间质纤维化病变的重要始动环节,而骨桥蛋白（OPN）是吸引肾间质巨噬细胞最重要的趋化因子,其表达量与间质炎症和纤维化程度密切相关。OPN不但趋化循环中的单核巨噬细胞到肾小管间质,而且直接刺激肾固有细胞如肾小管上皮细胞,启动或扩大炎症反应,而炎症反应可导致肾小管变性损伤,继而肾间质成纤维细胞活化、肾小管萎缩消失。研究发现在肾小管最初受损时,OPN还可促进肾小管上皮细胞再生和重建,帮助其功能的恢复,但随着病情的发展,病变逐渐严重,这种作用失代偿。由此可推断通过局部阻断OPN因子,抑制单核巨噬细胞在肾间质的聚集与增殖,可达到减轻炎症反应,减轻肾小管损伤、抑制纤维化的目的。替米沙坦是一种新型血管紧张素II1型受体（AT1R）拮抗剂,在肾脏疾病治疗中具有降低血压、减少蛋白尿、保护肾功能的作用。目前尚未检索到替米沙坦对于OPN的调节作用。本课题拟通过输尿管结扎建立大鼠肾间质纤维化动物模型,研究OPN及增殖细胞核抗原（PCNA）在肾间质纤维化时的表达,从细胞因子水平探讨替米沙坦减轻肾间质巨噬细胞的浸润及间质纤维化。探讨替米沙坦抗间质纤维化,延缓肾脏病变进展,保护肾功能的机制。方法:选择清洁级健康雄性SD大鼠72只,体重（210±10）克,随机分为三组:假手术组（A组n=24）,输尿管结扎组（B组n=24）,替米沙坦（美卡素勃林格殷格翰BoehringerIngelheim制造）治疗组（C组n=24）。将各组大鼠以水合氯醛（0.1ml/kg）腹腔注射麻醉后,行左侧耻骨上切口,沿左肾下极寻找到左侧输尿管,在中上1/3处用4号线上下结扎两处,然后从中剪断输尿管,以防逆行性感染,A组除不结扎和剪断输尿管外,其他手术过程同前。术后各组大鼠均正常饮食。A组和B组大鼠用生理盐水2ml灌胃,1次/日;C组大鼠以美卡素混悬液27mg/kg/d灌胃,1次/日。三组均于术前一天开始灌胃至术后第1、4、7、14d每组大鼠各取6只处死,快速取出左肾,按冠状位纵形切开,取肾组织的1/2置于10%福尔马林固定液固定,酒精逐级脱水,二甲苯透明石蜡包埋,制成5um切片。在第14天处死大鼠时收集3ml血标本及处死前24h尿液.24h尿送检尿肌酐、尿蛋白,血标本送检肌酐.光镜HE染色观察肾脏病理变化。采用免疫组织化学染色测定肾间质OPN、肾小管上皮细胞PCNA的表达及肾间质单核巨噬细胞数的变化,结果应用图像分析系统进行半定量分析。实验结果均以均数±标准差（x±s）表示,各组间比较采用单因素方差分析,相关分析采用直线相关分析,应用SAS统计分析软件对实验数据进行统计学处理,P<0.05为有统计学意义。结果:各组大鼠生化检查结果,与A组相比,B组及C组大鼠肌酐清除率（CCR）、24h尿蛋白定量均无明显变化。光镜下观察,HE染色A组未见异常。HE染色可见B组及C组各时相点大鼠肾脏肾小球均无明显变化。B组术后3天肾小管扩张不明显,可见肾间质炎症细胞局灶浸润,肾间质宽度增加;第7天肾小管扩张明显,上皮细胞变性、水肿、甚至坏死,肾间质大量炎症细胞浸润,间质宽度明显增加,偶见萎缩肾小管;第14天上述病变加重,可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩,小管基底膜不同程度断裂,皮质及外髓萎缩的肾小管较多,间质中大量淋巴单核细胞浸润,纤维化较明显。免疫组织化学结果显示:①OPN在A组肾组织的亨利氏襻升支粗段、远曲小管、集合管均有少量持续表达,而在肾小球内基本无表达。B组大鼠梗阻侧肾小管-间质中OPN表达较A组明显增加（P<0.05）且于术后第4d达高峰, OPN主要分布在肾小管上皮细胞胞浆及肾小管上皮刷状缘,部分间质细胞亦有表达;C组大鼠在术后各时间点肾小管-间质OPN表达均明显低于B组,但仍高于A组（P<0.05,P<0.05）。②PCNA在肾小管上皮细胞核表达。A组在整个过程中肾小管细胞只有低度增殖活动。B组肾小管PCNA表达第4d时已升至高峰,随后下降,14d时已低于A组。C组肾小管同样存在增殖,PCNA表达较B组高（P<0.05）。肾间质巨噬细胞的浸润:A组各时期偶可见到巨噬细胞的浸润。B组术后第3天可见少量巨噬细胞浸润,第7天可见多量巨噬细胞浸润,第14天有所减少,均高于A组（P<0.05）。C组与A组同时期相比巨噬细胞均升高,有统计学差异（P<0.05）。C组与B组同时相相比巨噬细胞数无明显减少,二者无统计学差异（P>0.05）。相关分析:OPN的表达与肾小管-间质ED-1阳性细胞数在各时间点呈正相关（r = 0.9852,0.9037,0.9298,0.9859,均P<0.05）。结论:随单侧输尿管结扎大鼠病情的进展,肾小管间质OPN表达增多,可能在肾间质纤维化中起重要作用。OPN可能通过介导巨噬细胞浸润参与肾间质纤维化,OPN可成为治疗肾间质纤维化的新靶点。血管紧张素II1型受体拮抗剂替米沙坦能够明显减轻肾间质纤维化,其分子机制可能是通过上调PCNA蛋白的表达,下调OPN的表达,从而发挥其在单侧输尿管结扎大鼠模型中延缓和抑制肾间质纤维化发展的保护作用。研究也发现替米沙坦对肾间质中巨噬细胞浸润无明显抑制作用。

论文目录

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• 研究论文 替米沙坦对骨桥蛋白在单侧输尿管结扎大鼠肾组织中表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 骨桥蛋白与肾间质纤维化
• 致谢
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