论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的典型病理表现出现之前,“自噬”已经广泛存在。在这一阶段,β淀粉样蛋白（amyloidβ-peptide, Aβ）衍生的可扩散性配体（Aβ-derived diffusible ligands, ADDLs）是核心致病因子。但是它与AD“自噬激活”的关系尚未明确。本研究旨在明确ADDLs体外诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬激活的效应,并初步探讨其作用机制。从以下三方面开展工作：1) ADDLs体外对SH-SY5Y自噬的激活作用。参照相关文献制备ADDLs,并对其进行性质鉴定。用免疫印迹（western blot, WB）检测不同剂量和不同作用时间ADDLs诱导自噬激活的标志物（marker）微管相关蛋白-Ⅰ（microtubule-associated protein light chain 3, LC3）-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达情况；以上实验用cAMP作为自噬诱导的阳性对照。2)研究ADDLs二级结构对SH-SY5Y自噬的激活的影响。制备不同二级结构的ADDLs,利用圆二色谱仪对不同二级结构的ADDLs进行具体数据分析,计算其中α螺旋和β折叠的含量。用WB检测不同二级结构对ADDLs诱导LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的影响；用免疫荧光检测LC3的细胞定位；用Lyso-tracker示踪和吖啶橙染色观察溶酶体激活情况。3)研究ADDLs诱导SH-SY5Y自噬的通路。检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）激活情况,通过检测其底物p-p70、总p70（t-p70）以及p-p70/p70（t-p70）比值,来判断ADDLs诱导自噬的细胞通路。结果发现：1) ADDLs体外诱导SH-SY5Y自噬的激活作用具有时间和剂量依赖性。时间为0 h、12 h、和24 h时,ADDLs诱导LC3表达量依次升高,在作用48 h时,LC3表达量开始下降；剂量为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L时,诱导LC3表达量逐渐增加,当剂量增加到80μmol/L时,LC3表达量开不再增加。2) ADDLs在组装过程中出现二级结构的变化,这种变化可诱导SH-SY5Y细胞的自噬激活,聚合时间为12～24 h时,α螺旋含量下降至4.5%,β折叠的含量增加至13.9%,在此期间内,可以检测到LC3表达量增加,以LC3-Ⅱ增加更明显。免疫荧光结果显示颗粒状“自噬小体”形态特征出现,以聚合24 h的ADDLs样品作用效果为明显,伴随Lyso-tracker阳性标记和吖啶橙着色颗粒的增加。3)在0-24 h范围内,随作用物聚集时间的延长,p-p70水平下降、总p70（t-p70）变化不明显,p-p70/p70（t-p70）比值下降,说明mTOR的活性被抑制,提示ADDLs诱导SH-SY5Y细胞自噬与mTOR途径相关。综上所述,ADDLs的作用时间、剂量和二级结构变化决定了SH-SY5Y细胞的自噬激活,具有LC3-Ⅱ阳性反应,并且与mTOR的抑制有关。本研究为进一步探讨ADDLs在AD“自噬激活”中的作用提供实验基础。
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相关论文文献
- [1].ADDLs对原代培养小鼠皮层神经元及星形胶质细胞混合培养体系Notch-1信号转导及HIF-1α表达的影响[J]. 卒中与神经疾病 2014(02)