水稻Pht1家族磷酸盐转运蛋白基因的时空表达特征研究

论文摘要

磷是植物生长发育必需的大量营养元素之一,尽管在土壤中含量很高,但是它在土壤中的有效性却非常低,使其成为植物生长的一个限制性因子。植物需要通过表达多种不同亲和的磷酸盐转运蛋白来吸收和转运土壤中的有效磷。水稻种植面积广,全世界有一半的人口都以稻米为食。尽管水稻中属于Phtl家族的全部13个磷酸盐转运蛋白基因的序列已经被揭示,但是对它们的研究有限,除了明确其中的两个基因,OsPhtl;11（OsPT11）和OsPhtl;13（OsPT13）分别受菌根强烈诱导和增强表达,其他Pht1基因的表达特征和功能还不了解。鉴于在过去发表的文章中已经将该家族的磷酸盐转运蛋白简单定义为OsPT,为了便于比较和简单化,本文中所有Pht1家族全部13个转运蛋白仍然采用OsPTs命名,按序列编号。为了研究OsPTs基因家族的时空表达模式和对磷素的响应机制,本研究构建了从模式品种日本晴（Oryza Sativa ssp. Japonica cv. Nipponbare）中12个Phtl基因的各个自身的启动子与GUS报告基因和GFP报告基因相连接的基因,并通过农杆菌介导转化到水稻（日本晴）。通过分析这些转基因水稻在缺磷和正常供磷情况下GUS （p-Glucuronidase）和GFP （Green Fluorescent Protein）报告基因的表达确定OsPhtls家族各个基因的时空表达特征。通过与启动子区域中顺式作用元件和不同植物中Pht1家族基因的同源性和表达特征的异同分析,进一步分析推测了水稻中各个Pht1家族转运蛋白在磷素吸收和转运方面的功能。所获主要结果如下：1.通过软件WOLFPSORT（http://wolfpsort.org/）分析亚细胞定位,发现OsPTs基因家族的所有基因都定位于细胞膜上。分析36个来自不同植物的Phtl家族基因的系统进化树表明,13个OsPTs基因进化关系非常接近,并且可以具体分为3个功能组。基因比对发现,13个OsPTs基因分别分布在水稻12条染色体中的第1,3,4,6,8和10号染色体上。启动子序列分析发现,W-box, PHO-like element和PlBS三个可能参与缺磷诱导表达基因的启动子中的基序在水稻13个OsPTs基因家族中分别有出现,而且在不同基因启动子中还有多个拷贝。2. RT-PCR分析发现,在营养液栽培的缺磷处理条件下,OsPTl, OsPT2, OsPT3, OsPT4, OsPT5, OsPT6, OsPT7, OsPT8和OsPT12在根部都检测到了基因表达,其中OsPT2,OsPT3,OsPT6和OsPT7缺磷条件下在根部增强表达；OsPTl,OsPT2,OsPT3, OsPT5,OsPT6,OsPT7,OsPT8和OsPT12在叶片中有基因表达,其中OsPT1, OsPT3, OsPT6,OsPT7和OsPT12缺磷条件下在叶片中增强表达。在我们的研究条件下,OsPT9,OsPT10,OsPT11和OsPTl3没有检测到基因表达信号。3.通过分析其内源启动子与GUS/GFP报告基因连接的转基因水稻植株中GUS/GFP的时空表达状况,按照GUS/GFP的表达的部位和强度与活性确定相应基因水稻中的表达特征。发现OsPT1在缺磷条件下,根尖、支根发生区、根茎结合部、叶片均有强烈表达；在正常供磷情况下,OsPT1的表达略有减弱,但表达部位没有发生明显改变。在OsPT1花药、灌浆期种子和发芽种子中都检测到了该基因的表达。OsPT2基因受缺磷强烈诱导表达,在缺磷三周后,水稻的根尖、支根发生区和根茎结合部都有OsPT2的强烈表达,且集中在根尖、支根发生区和根茎结合部的中柱部位,但在表皮和皮层细胞没有表达。在灌浆期种子和发芽种子中也有OsPT2的表达。OspT3在缺磷条件下,根尖、支根发生区都有基因表达,而且在根部缺磷条件下基因表达比供磷条件有明显增强。在灌浆期种子和发芽种子中也有OsPT3基因的表达。OspT4在缺磷和供磷条件下根尖和支根发生区都有微弱的表达。但OsPT4在叶片、灌浆期种子和发芽种子没有表达。OsPT5在缺磷三周后,根尖、支根发生区、根茎结合部和叶片均有很微弱的表达,但是在供磷条件下其表达消失；在花药、灌浆期种子和发芽种子均没有OsPT5基因的表达。OsPT6定受缺磷强烈特异诱导表达的基因,缺磷三周后,在根尖、支根发生区、根茎结合部、叶片、花药的中线部和发芽种子中都检测到OsPT6基因的强烈表达。在灌浆期种子没有检测到OsPT6基因表达。OsPT7在缺磷处理下,支根发生区和叶片表达强烈,但根尖没有检测到该基因的表达,而在供磷条件下,基本检测不到OsPT7基因在叶片中的表达。在花药中检测到了OsPT7的表达。OsPT8无论在缺磷或者供磷条件下,除了根冠外的根系和叶片各部位都能检测到强烈的表达,用其启动子与GFP连接基因的转水稻植株中的GFP表达分析同样重复了GUS报告基因表达的结果。与RT-PCR分析结果一致,OsPT9、OsPT10、 OsPT11和OsPT13四个基因在本溶液栽培试验研究条件下,缺磷和正常供磷处理三周后的水稻植株中均没有检测到它们的表达。4.根据顺势作用元件（cis-elements）分析结果,结合RT-PCR和转基因水稻检测结果,推测W-box和P1BS两个基序协同调控水稻缺磷条件下的基因表达,而PHO-like element可能对磷信号途径中磷酸盐转运蛋白表达调控作用有限。5.推测OsPT1,OsPT2,OsPT3,OsPT5,OsPT6和OsPT7六个磷酸盐转运蛋白在水稻缺磷条件下对磷素的吸收有重要作用；OsPTl, OsPT2, OsPT6, OsPT7和OsPT8五个磷酸盐转运蛋白与水稻缺磷条件下磷素的再转运有关；OsPTl, OsPT2, OsPT3, OsPT4, OsPT6和OsPT8六个磷酸盐转运蛋白在种子发芽过程中参与了磷素的转运。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 植物磷素营养的生理功能和分子生物学机制
• 1.1 植物对低磷营养胁迫的生理学适应机制
• 1.1.1 与活化土壤难溶性磷有关的生理生化机制
• 1.1.2 根系对低浓度可溶性磷有效吸收的形态学机制
• 1.1.3 菌根改善作物根系对土壤磷吸收的作用机制
• 1.1.4 糖酵解途径的适应性变化
• 1.2 植物磷酸盐转运蛋白的表达与调控
• 1.2.1 磷酸盐转运蛋白的作用与结构
• 1.2.2 Pht1家族磷酸盐转运蛋白基因
• 1.2.3 Pht2家族磷酸盐转运蛋白基因
• 1.2.4 Pht3家族磷酸盐转运蛋白基因
• 2 报告基因技术及其选择应用
• 2.1 报告基因概念和原理
• 2.3 报告基因的分类
• 2.4 报告基因的选择与应用
• 3 本研究的目的意义和研究计划
• 第二章 水稻Pht1家族基因生物信息学分析
• 1 方法
• 1.1 水稻Pht1家族基因染色体和氨基酸序列分析
• 1.2 水稻Pht1家族基因与其它Pht1家族基因进化树分析
• 1.3 水稻Pht1家族基因的亚细胞定位（软件分析）
• 1.4 水稻Pht1家族基因启动子基序分析
• 2 结果与分析
• 2.1 水稻Pht1家族基因染色体位点、氨基酸序列及进化树分析
• 2.2 水稻Pht1家族基因的亚细胞定位（软件分析）
• 2.3 水稻Pht1家族基因启动子基序分析
• 3 讨论
• 第三章 水稻Pht1家族基因表达特征
• 1 材料
• 1.1 水稻材料
• 1.2 生物试剂
• 2 方法
• 2.1 试验处理与取样
• 2.2 RNA提取与RT-PCR
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第四章 Pht1家族基因的时空表达分析
• 1 材料
• 1.1 水稻材料
• 1.2 菌株、质粒
• 1.3 生物试剂
• 2 方法
• 2.1 Pht1家族基因时空表达载体的构建
• 2.2 农杆菌介导的水稻转化
• 2.3 转基因苗的锻炼
• 2.4 转基因苗的检测
• 2.5 转基因苗的移栽
• 2.6 转基因材料处理
• 3 结果与分析
• 3.1 Ubiquitin的表达模式
• 3.2 OsPT1的表达模式
• 3.3 OsPT2的表达模式
• 3.4 OsPT3的表达模式
• 3.5 OsPT4的表达模式
• 3.6 OsPT5的表达模式
• 3.7 OsPT6的表达模式
• 3.8 OsPT7的表达模式
• 3.9 OsPT8的表达模式
• 3.10 OsPT9、OsPT10、OsPT11、OsPT13的表达模式
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 研究前景与展望
• 创新点
• 附录
• 研究生期间发表论文
• 致谢