针对IgE介导性疾病治疗性疫苗的研究

论文摘要

目的: IgE介导性疾病是一类由IgE引发的变态反应性疾病的统称,因其易感者在接触环境中变应原时往往产生过多的IgE抗体,通常伴有一种以上的变态反应性疾病而得名。当变应原初次进入机体后,选择性诱导特异性B细胞产生IgE抗体应答,而血清中游离的IgE可在不结合抗原的情况下通过其Fc片段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面受体结合使机体处于致敏状态。机体再次接触变应原后,多价变应原与致敏细胞表面两个或者两个以上相邻的IgE抗体结合,使细胞膜表面受体发生交联,触发致敏细胞脱颗粒,合成及释放生物活性介质,从而引起局部或者全身过敏反应。IgE介导性疾病通常包括特应性皮炎（Atopic Dermatitis,AD）、变应性鼻炎（Allergic Rhinitis,AR）、支气管哮喘（Asthma,AS）等,症状重者可导致过敏性休克,危及生命。变态反应性疾病已严重干扰了患者的工作和生活,由此带来的社会负担也是相当可观的。由于IgE在变态反应性疾病的发生发展环节中的重要作用,目前已经成为抗变态反应性疾病治疗的一个新的靶点和研究热点。IgE的分子结构已清楚,在人IgE抗体中与髙亲和力受体和低亲和力受体结合的位点重点位于Cε3结构域,虽然针对此区域的单克隆抗体已经FDA批准上市并在临床应用中显示出了良好的效果,但是,造价的昂贵和使用上的不便限制了其广泛应用,因此,由被动地接受这种抗体蛋白转向寻求针对该蛋白的主动免疫疫苗有着更好的应用前景。本课题拟构建能够诱导出针对IgE受体结合位点（Cε3结构域）特异性中和抗体的治疗性疫苗,通过抗原抗体结合产生的原子空间排列效应或诱导的构像改变来封闭IgE Fc片段上与IgE Fc受体结合的部位,进而阻断由IgE介导的变态反应性疾病效应途径,为IgE介导性疾病的治疗提供新的途径。方法:我们利用全基因组PCR的方法扩增出小鼠IgE受体结合位点（Cε3结构域）的基因片断,并构建了针对此区域的基因疫苗和蛋白疫苗;运用多种B细胞表位预测法分析并筛选出Cε3区域的表位以构建多肽疫苗。为了打破疫苗的免疫耐受和加强疫苗免疫原性,我们在构建IgE受体结合位点蛋白疫苗和基因疫苗时在其N-端插入了来源于破伤风毒素的具有激活Th细胞作用的通用Th细胞表位TT830-844;构建多肽疫苗时,人工合成该线形表位肽所对应的四分支多聚抗原肽（Multiple Antigenic Peptide,MAP）以增强免疫效果。将小鼠随机分为健康组（H）、哮喘组（A）、空载体组（pVAC-cms）、基因疫苗组（pVAC-CH3-TT）、蛋白疫苗组（pQE30-CH3-TT）、多聚抗原肽组（MAP）进行免疫,ELISA法检测各组血清抗体滴度。免疫完毕,除健康组外其余五组均采用卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）制造小鼠哮喘模型,通过对血清抗体滴度、哮喘系列指标的测定以及肺组织病理切片的鉴定综合评估几种疫苗对哮喘的抑制效果。结果:基因疫苗构建结果显示,融合了TT表位的CH3基因片断与质粒pVAC-cms重组后,瞬时转染CHO细胞,经RT-PCR、Western-Blot鉴定CH3-TT重组蛋白在CHO细胞中明显表达;纯化后,OD260/280比值和电泳结果显示,重组质粒pVAC-CH3-TT基因疫苗符合免疫动物的质量要求。蛋白疫苗构建结果显示,我们在大肠杆菌中成功地克隆、表达了CH3-TT融合蛋白,该蛋白以包涵体形式表达。运用多种B细胞表位预测法并结合以往文献筛选出一条Cε3区域的表位肽并化学合成该线形肽对应的四分支MAP。三种候选疫苗在小鼠身上进行了免疫试验,经ELISA法检测均可诱导出特异性的IgE受体结合位点中和抗体,其中MAP组的抗体滴度约为1:6400,基因疫苗和蛋白疫苗组的抗体滴度约为1:3200。在OVA所致的哮喘模型中,肺组织病理切片可见支气管周围、血管周围的炎症细胞尤其是嗜酸性粒细胞浸润,杯状细胞增生,上皮下纤维化、胶原增生等症状,肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Fluid,BALF）中的炎症细胞明显增多,而在健康对照组则未见以上现象;小鼠哮喘模型之前给予疫苗免疫者,肺内嗜酸性粒细胞浸润程度明显减少,上皮结构基本正常,其中基因疫苗组pVAC-CH3-TT BALF中嗜酸粒细胞占（1.9±1.8）%,蛋白疫苗组pQE30-CH3-TT为（4.2±1.8）%,多聚抗原肽组MAP为（4.0±2.8）%,均显著低于哮喘模型组（12.3±2.1）%和空载体组（11.8±5.7）%（P<0.01）,另外pVAC-CH3-TT组嗜酸性粒细胞比率低于pQE30-CH3-TT组和MAP组,具有统计学差异（P<0.05）;在小鼠造模前进行疫苗免疫可明显抑制肺内IL-4浓度和血清中IgE含量,与哮喘组肺内IL-4浓度（50.30±18.76）pg/mL相比,pVAC-CH3-TT组、pQE30-CH3-TT组、MAP组肺内IL-4浓度明显降低,分别为（14.02±9.36）pg/mL,（20.88±13.48）pg/mL,（18.14±13.19）pg/mL（P<0.05）;血清IgE含量的OD值测定中,pVAC-CH3-TT组的OD值为（0.10±0.02）,pQE30-CH3-TT组为（0.21±0.03）,MAP组为（0.18±0.05）,均较哮喘组（0.47±0.03）有显著降低（P<0.01）,其中pVAC-CH3-TT组的血清IgE含量的OD值要显著低于其他两个疫苗组（P<0.05）。三个疫苗组能显著抑制肠系膜上肥大细胞脱颗粒（P<0.05）,但其脱颗粒百分率仍与健康小鼠有差异（P<0.05）。各疫苗组对小鼠耳廓肿胀程度、小鼠体重以及肺湿重无显著影响（P>0.05）。结论:本实验分别构建了针对小鼠IgE受体结合位点的基因疫苗、蛋白疫苗和多聚抗原肽疫苗。用适当剂量的三种IgE受体结合位点疫苗免疫小鼠可明显抑制哮喘小鼠血清中IgE的含量,过敏原所致的肺内炎症指标有所减轻,对腹腔肥大细胞脱颗粒现象有一定程度的抑制。三种疫苗动物免疫结果分析表明,基因疫苗免疫效果略好于多聚抗原肽疫苗和蛋白疫苗疫苗,为进一步利用与IgE分子结构相关的主动免疫策略治疗过敏性哮喘探索了新的途径。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 第一部分 IgE 受体结合位点疫苗的制备
• 1 实验设计和目的
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 第二部分 动物免疫实验及哮喘抑制效果鉴定
• 1 实验设计和目的
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历
• 论文发表情况
• 致谢