bcr/abl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病样模型的建立

论文摘要

慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种起源于异常多能造血干细胞的克隆增殖性疾病,bcr/abl融合基因的持续表达在该病的形成过程中起重要作用。目前,国内对CML发病机制和治疗的研究主要选用含有bcr/abl融合基因的体外细胞模型、bcr/abl转化的造血细胞株在小鼠体内的定殖模型或K562细胞移植裸鼠成皮下瘤后,再接种到免疫缺陷小鼠建立CML模型鼠的方法[1]。而利用逆转录病毒介导的小鼠骨髓转导、移植模型研究人类CML的发生、发展及其生物学特性,是20世纪90年代以来国外该领域研究的新进展[2],国内尚未见相关报道。本课题以bcr/ab逆转录病毒Mig210为载体,经包装细胞包装后收集病毒上清并测定滴度,感染经5-FU预处理的Balb/c雄性小鼠骨髓细胞,再回输到经致死剂量γ射线照射后的同种雌性受体鼠中,首次成功建立了CML小鼠移植模型。并在此基础上又建立了再次移植模型。其主要方法、结果及结论如下:1.bcr/ab逆转录病毒介导的慢性粒细胞白血病样小鼠模型的首次建立含bcr/abl癌基因的逆转录病毒Mig210载体经Phoenix-Ampo细胞包装后,收集病毒上清液并测定其滴度后感染经5-FU预处理的Balb/c雄性小鼠骨髓细胞,再经尾静脉移植入经致死剂量γ射线（900cGy）照射的同种雌性受体鼠中后,通过外周血和骨髓细胞形态学、肝脏和脾脏组织学观察,RT-PCR和western blot分别检测bcr/abl在mRNA和蛋白水平的表达情况,鉴定小鼠成模状况。移植89周后,外周血白细胞达（20～30）×1010/L（为对照鼠的58倍）,外周血涂片幼稚细胞达到10%20%;骨髓粒系细胞显著增高,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润;移植45周后在受体鼠骨髓和脾脏检出bcr/abl融合基因,89周后在肝脏检测出bcr/abl融合基因,同时在骨髓和脾脏也检测到BCR/ABL融合蛋白,建模成功的小鼠35月后相继死亡。为了提高CML成模率,在实验过程中还优化和改进了方法:用纤维连接蛋白作基质进行病毒上清和骨髓细胞的共感染,使活细胞增加20%30%,且更易附着于瓶底,细胞状态也更好;用2mg10mg/10g的5-FU预处理雄性供体Balb/c小鼠,对小鼠骨髓原始细胞相对数量无明显性影响;回输给受体鼠感染了病毒的骨髓细胞数量分别为0.2×106个、0.4×106个、0.6×106个和1.0×106个时,小鼠CML成模率分别为60%、80%、90%和90%。2.bcr/abl逆转录病毒介导的小鼠CML二次移植模型的建立收集成功建模的CML小鼠模型的骨髓细胞或脾细胞,经尾静脉输入经亚致死剂量γ射线（450cGy）照射的同种雌性受体鼠中,通过脾集落形成实验、骨髓形态学观察、Y染色体及其特异性性别决定基因Sry检测、bcr/abl在mRNA和蛋白水平的表达情况,分析鉴定CML小鼠二次移植模型成模情况。结果显示:移植后12天,肉眼可见明显的脾结节形成,连续切片可见成堆脾集落;移植45周后,在雌性受体小鼠骨髓中检出相似Y染色体及Y染色体特异性Sry基因,骨髓和脾脏中检出bcr/abl融合基因;移植68周后外周血白细胞升高至正常未处理小鼠的48倍,粒系明显增高至2032×109个/L;外周血涂片幼稚细胞达10%20%;骨髓涂片结果显示粒系显著增高,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润,同时,在肝脏检测出bcr/abl融合基因;骨髓检测到BCR/ABL融合蛋白的表达;移植后18周后,外周血涂片幼稚细胞30%以上,小鼠发生急变,最终以肺出血相继死亡。综上所述,本课题在国内首次成功建立了bcr/abl逆转录病毒介导的CML小鼠模型,并进行了一系列实验条件优化,成功建立了二次移植模型,为后续CML信号通路和治疗机制的研究奠定了实验基础。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 bcr/abl 逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病样模型的首次构建
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 bcr/abl 逆转录病毒介导的小鼠慢粒白血病样模型的二次移植模型的建立
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附图
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士期间的研究成果及发表学术论文目录