Cloning, Tissue Expression and Bioinformation Analysis of C4H, C3H and CCR Gene of Lignin Biosynthesis Enzymes in Neosinocalamus Affinis

论文摘要

随着社会经济的飞速发展，我国造纸工业也进入快速增长期。但在造纸工业中，木质素脱除是造成环境污染的重要来源。因此，选择具有低木质素含量、木质素易于去除的优质植物材料生产纸浆，对造纸工业的发展以及环境保护都具有重要的意义。本研究以慈竹为研究材料，采用RACE和RT-PCR技术对慈竹嫩茎部位的C4H、C3H和CCR基因进行全长克隆，并对克隆获得的完整基因进行生物信息学分析和组织表达。通过研究得出如下主要结果：1.采用RACE和RT-PCR技术克隆得到了慈竹3个编码木质素合成酶全长基因，分别命名为NaC4H、NaC3H和NaCCR1，GenBank上注册号分别为JN571418、JF693629和JQ669677。2.对慈竹NaC4H和NaC3H进行生物信息学分析发现，NaC4H和NaC3H都属于细胞色素CYP450家族蛋白；其编码蛋白很可能定位在内质网（膜）上；其二级结构含有丰富的α－螺旋和无规卷曲，β－转角和延伸链的含量较少；其三级结构预测，可以更加直观地看到α－螺旋、β－转角、无规卷曲和延伸链，以及其蛋白质折叠空间结构构象的变化；其编码蛋白含有无序化区域。3.克隆得到的慈竹NaC3H和NaC4H基因组织中的RT-PCR表达分析表明，NaC3H基因在笋中部和笋下部，茎上部、中部和下部的表达较强，而在未展开叶、展开叶和笋的上部表达较弱；NaC4H基因在未展开叶、展开叶、笋中部和下部、茎中部和下部表达较强，而在笋上部和茎上部表达较弱。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 研究目的与意义
• 1.2 木质素及其合成途径
• 1.2.1 木质素概述
• 1.2.2 竹木质素
• 1.2.3 木质素生物合成中的几种重要酶
• 1.2.4 木质素生物合成途径
• 1.3 木质素生物合成的基因调控
• 1.3.1 木质素生物合成基因调控策略
• 1.3.2 木质素生物合成基因调控研究现状
• 1.4 木质素含量调控
• 1.4.1 肉桂酸-4-羟化酶
• 1.4.2 肉桂酸-3-羟化酶和对羟基-肉桂酰辅酶 A 莽草酸/荃宁酸酯转移酶
• 1.4.3 肉桂酰辅酶 A 还原酶
• 1.5 CDNA 末端的快速克隆技术（RACE 技术）
• 1.6 RNA 干扰（RNAI）技术
• 1.7 研究主要内容及技术路线
• 1.7.1 研究主要内容
• 1.7.2 技术路线
• 2 慈竹 C4H 基因保守区的克隆
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验用主要试剂、菌种
• 2.1.3 试验用其他主要试剂的配置
• 2.1.4 试验用主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 慈竹嫩茎总 RNA 的提取
• 2.2.2 慈竹嫩茎 cDNA 的合成
• 2.2.3 慈竹 C4H 基因保守区的 PCR 扩增
• 2.2.4 慈竹 C4H 基因保守区的克隆
• 2.2.5 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.6 转化
• 2.2.7 阳性克隆的筛选
• 2.2.8 序列测定
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 RNA 提取结果
• 2.3.2 慈竹 C4H 保守区克隆
• 2.3.3 慈竹 C4H 保守区 PCR 产物克隆的酶切验证
• 2.3.4 慈竹 C4H 保守区的生物信息学分析
• 2.4 结论
• 3 慈竹 C4H 基因的 5ˊ端克隆
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试验用主要试剂、菌种
• 3.1.3 试验用其他主要试剂的配置
• 3.1.4 试验用主要仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 慈竹嫩茎总 RNA 的提取
• 3.2.2 慈竹嫩茎 5ˊRACE 特异 cDNA 的合成
• 3.2.3 慈竹 C4H 基因的 5ˊRACE PCR 扩增
• 3.2.4 慈竹 C4H 基因的 5ˊRACE PCR 产物的克隆
• 3.2.5 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备
• 3.2.6 转化
• 3.2.7 阳性克隆的筛选
• 3.2.8 序列测定
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 慈竹 C4H 基因的 5ˊRACE PCR 扩增
• 3.3.2 慈竹 C4H 基因的 5ˊRACE PCR 产物克隆的酶切验证
• 3.3.3 慈竹 C4H 基因的 5ˊ端基因的生物信息学分析
• 3.4 结论
• 4 慈竹 C4H 基因的 3ˊ端克隆
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试验用主要试剂、菌种
• 4.1.3 试验用其他试剂的配置
• 4.1.4 试验用主要仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 慈竹总 RNA 的提取
• 4.2.2 慈竹 cDNA 的合成
• 4.2.3 慈竹 C4H 基因的 3ˊRACE PCR 扩增
• 4.2.4 慈竹 C4H 的 3ˊRACE PCR 产物的克隆
• 4.2.5 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备
• 4.2.6 转化
• 4.2.7 阳性克隆的筛选
• 4.2.8 序列测定
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 慈竹 C4H 基因的 3ˊRACE PCR 扩增
• 4.3.2 慈竹 C4H 基因的 3ˊRACE PCR 产物克隆的酶切验证
• 4.3.3 慈竹 C4H 基因的 3ˊ端基因的生物信息学分析
• 4.4 结论
• 5 慈竹 C4H 基因全长序列的获得
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 试验用主要试剂、菌种
• 5.1.3 试验用其他主要试剂的配置
• 5.1.4 试验用主要仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 慈竹嫩茎总 RNA 的提取
• 5.2.2 慈竹嫩茎 cDNA 的合成
• 5.2.3 慈竹 C4H 基因全长的 PCR 扩增
• 5.2.4 慈竹 C4H 基因全长的克隆
• 5.2.5 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备
• 5.2.6 转化
• 5.2.7 阳性克隆的筛选
• 5.2.8 序列测定
• 5.3 结果分析
• 5.3.1 慈竹 C4H 基因全长的 PCR 扩增
• 5.3.2 慈竹 C4H 基因全长的 PCR 产物克隆的酶切验证
• 5.3.3 慈竹 C4H 基因全长序列的获得
• 5.4 慈竹 C4H 的生物信息学分析
• 5.4.1 试验数据
• 5.4.2 研究方法
• 5.4.3 结果与分析
• 5.5 结论
• 6 慈竹 C3H 基因全长序列的获得
• 6.1 试验材料
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 试验用主要试剂、菌种
• 6.1.3 试验用其他主要试剂的配置
• 6.1.4 试验用主要仪器
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 慈竹嫩茎总 RNA 的提取
• 6.2.2 慈竹嫩茎 cDNA 的合成
• 6.2.3 慈竹 C3H 基因全长的 PCR 扩增
• 6.2.4 慈竹 C3H 基因全长的克隆
• 6.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 6.2.6 转化
• 6.2.7 阳性克隆的筛选
• 6.2.8 序列测定
• 6.3 结果分析
• 6.3.1 慈竹 C3H 基因全长的 PCR 扩增
• 6.3.2 慈竹 C3H 基因全长 PCR 产物克隆的酶切验证
• 6.3.3 慈竹 C3H 基因全长序列的获得
• 6.4 慈竹 C3H 的生物信息学分析
• 6.4.1 试验数据
• 6.4.2 研究方法
• 6.4.3 结果分析
• 6.4.4 结论
• 7 慈竹 C3H RNAI 表达载体的构建
• 7.1 试验材料
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 试验用主要试剂、菌种
• 7.1.3 试验用其他主要试剂的配置
• 7.1.4 试验用主要仪器
• 7.2 试验方法
• 7.2.1 慈竹嫩茎总 RNA 的提取
• 7.2.2 慈竹嫩茎 cDNA 的合成
• 7.2.3 慈竹 C3H RNAi 目标片段的扩增
• 7.2.4 慈竹 C3H RNAi 目标片段的克隆与测序
• 7.2.5 中间表达载体 pSK-C3H-RNAi 的构建
• 7.2.6 pBI-C3H-RNAi 质粒转化农杆菌 EHA10566
• 7.3 结果分析
• 7.3.1 慈竹 C3H RNAi 目标片段的扩增
• 7.3.2 慈竹 C3H RNAi 目标片段的克隆
• 7.3.3 慈竹 C3H RNAi 目标片段的序列分析
• 7.3.4 中间表达载体 pSK-C3H-RNAi 的构建与鉴定
• 7.3.5 植物表达载体 pBI-C3H-RNAi 的构建与鉴定
• 7.3.6 pBI-C3H-RNAi 质粒转化农杆菌
• 7.4 结论
• 8 慈竹 CCR 基因保守区的克隆
• 8.1 试验材料
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 试验用主要试剂、菌种
• 8.1.3 试验用其他主要试剂的配置
• 8.1.4 试验用主要仪器
• 8.2 试验方法
• 8.2.1 慈竹嫩茎总 RNA 的提取
• 8.2.2 慈竹嫩茎 cDNA 的合成
• 8.2.3 慈竹 CCR 基因保守区的 PCR 扩增
• 8.2.4 慈竹 CCR 基因保守区的克隆
• 8.2.5 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备
• 8.2.6 转化
• 8.2.7 阳性克隆的筛选
• 8.2.8 序列测定
• 8.3 结果分析
• 8.3.1 慈竹 CCR 保守区克隆
• 8.3.2 酶切验证
• 8.3.3 慈竹 CCR 保守区的生物信息学分析
• 8.4 结论
• 9 慈竹 CCR 基因的 5ˊ端克隆
• 9.1 试验材料
• 9.1.1 材料
• 9.1.2 试验用主要试剂、菌种
• 9.1.3 试验用其他主要试剂的配置
• 9.1.4 试验用主要仪器
• 9.2 试验方法
• 9.2.1 慈竹嫩茎总 RNA 的提取
• 9.2.2 慈竹嫩茎 5ˊRACE 特异 cDNA 的合成
• 9.2.3 慈竹 CCR 基因的 5ˊRACE PCR 扩增
• 9.2.4 慈竹 CCR 基因的 5ˊ端基因的扩增
• 9.2.5 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备
• 9.2.6 转化
• 9.2.7 阳性克隆的筛选
• 9.2.8 序列测定
• 9.3 结果分析
• 9.3.1 慈竹 CCR 基因的 5ˊRACE PCR 扩增
• 9.3.2 慈竹 CCR 基因的 5ˊRACE PCR 产物的克隆
• 9.3.3 慈竹 CCR 基因的 5ˊRACE PCR 产物的生物信息学分析
• 9.4 结论
• 10 慈竹 CCR 基因全长序列的获得
• 10.1 试验材料
• 10.1.1 材料
• 10.1.2 试验用主要试剂、菌种
• 10.1.3 试验用其他主要试剂的配置
• 10.1.4 试验用主要仪器
• 10.2 试验方法
• 10.2.1 慈竹嫩茎总 RNA 的提取
• 10.2.2 慈竹嫩茎 cDNA 的合成
• 10.2.3 慈竹 CCR 基因全长的 PCR 扩增
• 10.2.4 慈竹 CCR 基因全长的克隆
• 10.2.5 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备
• 10.2.6 转化
• 10.2.7 阳性克隆的筛选
• 10.2.8 序列测定
• 10.3 结果分析
• 10.3.1 慈竹 CCR 全长基因的克隆
• 10.3.2 慈竹 CCR 基因全长 PCR 产物克隆的酶切验证
• 10.3.3 慈竹 CCR 基因全长序列的生物信息学分析
• 10.4 结论
• 11 慈竹 C4H 和 C3H 基因的组织表达分析
• 11.1 试验材料
• 11.1.1 材料
• 11.1.2 试验用主要试剂
• 11.2 试验方法
• 11.2.1 慈竹 NaC3H、NaC4H 和 Tublin 基因半定量 RT-PCR 引物
• 11.2.2 慈竹总 RNA 的提取
• 11.2.3 慈竹 cDNA 的合成
• 11.2.4 慈竹 NaC3H、NaC4H 和 Tublin 基因半定量 RT-PCR 反应体系
• 11.2.5 慈竹 NaC3H、NaC4H 和 Tublin 基因半定量 RT-PCR 反应程序
• 11.2.6 慈竹 NaC3H、NaC4H 和 Tublin 基因半定量 RT-PCR 电泳检测
• 11.3 结果分析
• 11.4 结论
• 12 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的与学位论文内容相关的学术论文及研究成果