芥子碱降解菌株的筛选及其降解机理的研究

论文摘要

菜粕是数量上仅次于豆粕的植物蛋白源,我国每年大约产生600-700万吨菜粕。随着菜籽双低（低硫甙、低芥酸）化进程的推进,酚类物质逐渐成为菜粕中的重要抗营养因子之一。芥子碱是菜粕中最重要的酚类物质之一,属于简单酚类,在菜粕中的含量为1.2%-2.3%,溶于水易发生水解反应,生成芥子酸和胆碱。芥子碱是使菜粕产生苦味的主要原因,亦能使褐壳鸡蛋产生鱼腥味,与蛋白质或酶结合会降低蛋白质消化吸收率。因此,筛选出能降解菜粕芥子碱的菌株,研究降解芥子碱的酶及其降解机理,不仅能解决菜粕饲料适口性差的问题,而且为菜粕的精深加工与利用、菜粕芥子碱的生物学活性研究与应用提供基础依据。本论文主要研究内容及结果如下：1.论文采用埋土法,经过富集培养基及筛选培养基交替培养,分离筛选出12株菌,其中霉菌6株,酵母3株,细菌3株。将从富含菜籽饼粕的土壤中筛选得到的菌株和实验室保存的15株菌,在相同条件下对菜籽饼粕进行固态发酵培养,通过总酚及芥子碱含量测定,测得其中4株菌降解能力较高,依次为变色栓菌、J-9、克氏假丝酵母、毕赤酵母。出于安全及研究需要,主要对其中的一个菌株J-9进行了研究,首先对该菌株进行了鉴定。通过对菌株J-9的形态观察和18SrDNA序列分析,可以鉴定该菌株为酿酒酵母。2.测定酿酒酵母产酶发酵液中几种酶的酶活,结果如下：β-葡萄糖苷酶酶活为7.68 IU（均值）,漆酶酶活为0.65IU,乙醇脱氢酶193.3IU,乙醛脱氢酶26.6IU,多酚氧化酶为19.1IU,阿魏酸酯酶0IU。判定酵母所产酶为β-葡萄糖苷酶,多酚氧化酶,乙醇、乙醛脱氢酶。3建立了测定芥子碱,芥子酸含量的方法-UPLC法,通过精密度试验,稳定性试验,重复性试验,回收率试验及线性关系考察,表明方法具有良好的稳定性及重现性,对于芥子碱、芥子酸也有较好的分离度。4采用β-葡萄糖苷酶,多酚氧化酶,乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶4种纯酶对芥子碱进行酶解,通过芥子碱含量测定最终确定降解芥子碱的酶为多酚氧化酶,β-葡萄糖苷酶,其降解率分别达到79.6%,17.65%。5通过考察酶解温度、时间、底物浓度、pH等因素,以菜粕芥子碱降解率为考察指标,选用Box-Behnken试验设计进行实验,优化出多酚氧化酶酶解菜粕芥子碱最佳工艺参数为：酶解时间30.56min,pH5.50,酶添加量为0.33mL,酶解温度为57.27℃,此时多酚氧化酶酶降解菜粕芥子碱降解率达84.93%。6对筛选到的酿酒酵母产多酚氧化酶及β-葡萄糖苷酶的产酶条件进行了优化。首先通过单因素和正交实验,得到了最佳培养基配比,即糖蜜3%,硫酸铵0.6%,菜粕添加量8%,硫酸亚铁0.1%；优化后的培养条件为：装液量80ml（300ml锥形瓶）,转速200r/min,培养温度30℃。培养基和培养条件优化后使得该菌株的多酚氧化酶酶活较优化前提高了近5倍,在发酵第2天时达到93.31IU/mL,β-葡萄糖苷酶在发酵第2天时达到20.93IU/mL。7通过正交试验对芥子碱降解率及酶活之间关系进行研究,发现酶活高低与降解率基本成正比关系,使用最佳培养基在最优培养条件下发酵培养后,芥子碱降解率比未优化前有明显提高,由之前的50.23%提高至76.75%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 菜籽饼粕的营养特点
• 2 菜籽饼粕的饲用现状
• 3 芥子碱的研究现状
• 3.1 理化性质
• 3.2 芥子碱检测方法
• 3.2.1 高效液相色谱
• 3.2.2 电化学法
• 3.2.3 光谱法
• 3.2.4 荧光扫描法
• 3.2.5 相滴定法
• 3.2.6 雷氏盐沉淀法
• 3.3 提取方法
• 3.4 毒性研究
• 3.4.1 抗雄激素活性
• 3.4.2 急性毒性
• 3.4.3 抗营养效应
• 3.5 芥子碱的脱除方法研究
• 3.6 芥子碱降解机理研究现状
• 4 论文研究目的、意义及内容
• 4.1 研究目的和意义
• 4.2 研究的基本思路与内容
• 4.2.1 芥子碱降解菌株的筛选与鉴定
• 4.2.2 降解菌株降解酶的确立
• 4.2.3 降解酶酶活的优化
• 第二章 芥子碱降解菌的筛选及菌株鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌株初筛
• 1.2.2 总酚及芥子碱测定方法
• 1.2.3 菌株形态观察
• 1.2.4 菌株18SrDNA鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株初筛
• 2.2 菌株复筛
• 2.3 菌株鉴定
• 2.3.1 形态观察
• 2.3.2 18SrDNA分析
• 3 小结
• 第三章 芥子碱降解酶的确立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 底物
• 1.2 主要化学试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 发酵液酶活测定
• 1.4.2 芥子碱硫氰酸盐的制备
• 1.4.3 UPLC法检测酶解液
• 2 结果与分析
• 2.1 发酵液酶活测定
• 2.2 UPLC测定芥子碱含量方法学考察
• 2.3 菜粕芥子碱酶解结果分析
• 2.3.1 多酚氧化酶酶解芥子碱结果及液相图谱分析
• 2.3.2 β-葡萄糖苷酶酶解芥子碱结果分析
• 2.3.3 酶解及降解的芥子碱结果与液相图谱分析
• 3 小结
• 第四章 多酚氧化酶酶解芥子碱条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 工艺优化设计
• 1.3.2 Box-Behnken试验设计
• 2 结果与分析
• 2.1 酶液添加量对芥子碱降解率的影响
• 2.2 pH值对芥子碱降解率的影响
• 2.3 酶解温度对芥子碱降解率的影响
• 2.4 酶解时间对芥子碱降解率的影响
• 2.5 Box-Behnken实验
• 2.5.1 模型的建立及其显著性检验
• 2.5.2 响应面分析与变化
• 3 小结
• 第五章 酿酒酵母产酶条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 粗酶液的制取
• 1.2.2 酶活测定
• 1.2.3 产酶发酵培养基优化
• 1.2.4 产酶发酵培养条件优化
• 1.2.5 正交试验设计
• 2 结果与分析
• 2.1 产酶发酵培养基的优化
• 2.1.1 菜粕添加量对产酶的影响
• 2.1.2 不同氮源对产酶的影响
• 2.1.3 氮源浓度对产酶的影响
• 2.1.4 不同碳源对产酶的影响
• 2.1.5 碳源浓度对产酶的影响
• 2.1.6 微量离子对产酶的影响
• 2.2 产酶发酵培养条件的优化
• 2.2.1 时间对产酶的影响
• 2.2.2 摇床转速对产酶的影响
• 2.2.3 培养基装液量对产酶的影响
• 2.2.4 培养温度对产酶的影响
• 2.2.5 pH值对产酶的影响
• 2.3 正交试验结果
• 3 小结
• 结论与展望
• 1 结论
• 2 创新点
• 3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间发表论文