生物活性肽刺激细胞增殖分化及相关功能研究

论文摘要

阿胶作为一种重要的中药已被发现具有多种功效，前期研究发现驴血清白蛋白为阿胶中重要的蛋白质组分之一，本课题主要研究源于驴血清白蛋白的生物活性肽HP-6，通过验证其功能活性，一方面为阿胶的药理研究提出新的思路，另一方面为其实际应用奠定理论基础。在此基础上，进一步探讨驴血清酶解物的功能，为驴血清的开发利用进行初步探索。体外试验研究肽HP-6对小鼠骨髓细胞及HL-60、HepG-2细胞增殖的影响，结果发现：1.肽HP-6可促进小鼠骨髓基质细胞增殖，在0.15μmol·L-1浓度时具最高增殖率（63.52±3.94）%，对小鼠骨髓悬浮细胞促增殖作用最高为0.015μmol·L-1时的（24.66±3.70）%；2.激光共聚焦显微术进行初步机理探讨，发现肽HP-6与小鼠骨髓细胞相互作用的靶标物质极有可能在细胞质内；3.小鼠骨髓CFU-E集落培养中发现低浓度的肽HP-6对于红细胞分化具有促进作用；4. HL-60细胞、HepG-2细胞及HepG-2集落的作用中，发现肽HP-6对这两种癌细胞增殖无促进作用，可见肽HP-6刺激细胞增殖时具有选择性。体内试验建立了失血性贫血小鼠模型和环磷酰胺致贫血模型，观察肽HP-6对这两种贫血模型的影响，结果发现肽HP-6可增强小鼠造血功能，并能够辅助小鼠造血系统抵抗化疗药物损伤。对小鼠生长发育影响研究中发现该肽可促进肝脏、肺脏发育，且未见长期生物毒性。胰蛋白酶水解驴血清初步的条件优化，发现在预处理温度85℃、初始pH9、单位体积未稀释驴血清的胰蛋白酶使用量2500U·mL-1、酶解温度55℃和酶解时间9h的条件下，本试验的驴血清可被有效降解，而酶解5h和7h的酶解物具有最好的刺激小鼠骨髓基质细胞增殖活性。动物试验结果表明，驴血清与胰蛋白酶的反应产物对于小鼠是安全无害的，可以在一定程度上促进小鼠的体重增长以及各主要脏器的发育，在大多数情况下，驴血清与灭活胰蛋白酶作用产物具有更好的促进效果，而对于肺部的发育，驴血清胰蛋白酶酶解物却有更好的作用。综上所述，通过生物信息学手段获得源于驴血清白蛋白的生物活性肽HP-6具有类似阿胶补血的功能，而富含驴血清白蛋白的驴血清酶解后也具有与肽HP-6相类似的功能。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 造血系统概况
• 1.1.1 造血器官
• 1.1.2 造血微环境
• 1.1.3 造血干/祖细胞
• 1.1.4 造血干细胞的发育
• 1.2 补血中药概述
• 1.2.1 常见补血中药
• 1.2.1.1 螺旋藻
• 1.2.1.2 地黄
• 1.2.1.3 黄芪
• 1.2.1.4 当归
• 1.2.1.5 阿胶
• 1.2.1.6 鸡血藤
• 1.2.1.7 白芍
• 1.2.1.8 复方中药
• 1.2.2 补血中药补血作用机制
• 1.2.2.1 微量元素
• 1.2.2.2 多糖类成分
• 1.2.2.3 皂甙类成分
• 1.2.2.4 蛋白及其降解物
• 1.2.2.5 其它物质
• 1.2.2.6 补血中药补血机制小结
• 1.3 阿胶的补血机制及开发应用研究进展
• 1.3.1 阿胶的补血机制
• 1.3.1.1 阿胶的传统药理学说
• 1.3.1.2 阿胶药理作用的结构学说
• 1.3.1.3 阿胶蛋白对补血功效的作用
• 1.3.2 阿胶的开发应用
• 1.4 动物血液的应用研究进展
• 1.5 课题研究的目的意义及主要研究内容
• 1.5.1 本课题研究的目的意义
• 1.5.2 本课题研究的主要内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验仪器设备
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要实验材料
• 2.2.2 主要实验试剂
• 2.2.3 实验中主要溶液的配制
• 2.2.3.1 DMEM 培养基的配制
• 2.2.3.2 RPMI 1640 培养基的配制
• 2.2.3.3 IMDM 培养基的配制
• 2.2.3.4 2×IMDM 培养基的配制
• 2.2.3.5 0.9 %甲基纤维素培养基的配制
• 2.2.3.6 PBS 缓冲液的配制
• 2.2.3.7 5 %醋酸液的配制
• 2.2.3.8 10 %水合氯醛的配制
• 2.2.3.9 Hank’s 液的配制
• 2.2.3.10 0.25 %胰蛋白酶消化液的配制
• 2.2.3.11 Giemsa 染色液的配制
• 2.2.3.12 2 %水合茚三酮溶液的配制
• 2.2.3.13 pH 8.0 缓冲溶液的配制
• 2.2.3.14 三联溶解液的配制
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 肽 HP-6 对骨髓基质细胞增殖试验
• 2.3.1.1 试验原理
• 2.3.1.2 小鼠骨髓基质细胞的分离
• 2.3.1.3 小鼠骨髓基质细胞增殖试验
• 2.3.2 肽 HP-6 对骨髓悬浮细胞增殖试验
• 2.3.2.1 小鼠骨髓悬浮细胞的分离
• 2.3.2.2 小鼠骨髓悬浮细胞增殖试验
• 2.3.3 肽 HP-6 促小鼠骨髓细胞增殖机制初探
• 2.3.3.1 试验原理
• 2.3.3.2 试验方法
• 2.3.4 肽 HP-6 影响骨髓细胞 CFU-E 集落形成试验
• 2.3.4.1 试验原理
• 2.3.4.2 试验方法
• 2.3.5 肽 HP-6 对 HepG-2 细胞增殖试验
• 2.3.6 肽 HP-6 影响 HepG-2 集落形成试验
• 2.3.6.1 细胞最佳接种浓度摸索
• 2.3.6.2 肽 HP-6 影响 HepG-2 集落形成试验
• 2.3.6.3 吉姆萨染色方法
• 2.3.7 肽 HP-6 对 HL-60 细胞增殖试验
• 2.3.8 肽 HP-6 对失血性贫血小鼠模型的影响试验
• 2.3.8.1 试验原理
• 2.3.8.2 失血性贫血小鼠模型的建立
• 2.3.8.3 动物的分组及给药
• 2.3.9 肽 HP-6 对环磷酰胺致贫血小鼠模型的影响试验
• 2.3.9.1 试验原理
• 2.3.9.2 环磷酰胺致贫血小鼠模型的建立
• 2.3.9.3 动物的分组及给药
• 2.3.10 肽 HP-6 对小鼠生长发育的影响试验
• 2.3.10.1 试验原理
• 2.3.10.2 试验方法
• 2.3.11 驴血清酶解条件初步优化试验
• 2.3.11.1 试验原理
• 2.3.11.2 试验方法
• 2.3.12 驴血清酶解物对骨髓基质细胞的增殖试验
• 2.3.12.1 待测试酶解物的制备
• 2.3.12.2 驴血清酶解物对骨髓基质细胞的增殖试验
• 2.3.13 驴血清酶解物对小鼠生长发育的影响试验
• 2.3.13.1 待测试酶解物的制备
• 2.3.13.2 驴血清酶解物对小鼠生长发育的影响试验
• 2.3.14 统计分析方法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 肽 HP-6 的体外作用结果与讨论
• 3.1.1 肽 HP-6 对小鼠骨髓基质细胞增殖的影响
• 3.1.1.1 小鼠骨髓基质细胞的分离培养
• 3.1.1.2 肽 HP-6 对小鼠骨髓基质细胞增殖的影响
• 3.1.2 肽 HP-6 对小鼠骨髓悬浮细胞增殖的影响
• 3.1.3 肽 HP-6 促小鼠骨髓细胞增殖初步机制
• 3.1.4 肽 HP-6 对小鼠骨髓细胞 CFU-E 集落形成的影响
• 3.1.4.1 小鼠骨髓细胞 CFU-E 集落形态
• 3.1.4.2 肽 HP-6 对小鼠骨髓细胞 CFU-E 集落形成的影响
• 3.1.5 肽 HP-6 对 HepG-2 细胞增殖的影响
• 3.1.6 肽 HP-6 对 HepG-2 集落形成的影响
• 3.1.6.1 HepG-2 集落培养最适细胞浓度选择
• 3.1.6.2 肽 HP-6 对 HepG-2 集落形成的影响
• 3.1.7 肽 HP-6 对 HL-60 细胞增殖的影响
• 3.1.8 肽 HP-6 体外作用小结
• 3.2 肽 HP-6 体内作用结果与讨论
• 3.2.1 肽 HP-6 对失血性贫血小鼠模型的影响
• 3.2.1.1 肽 HP-6 对失血性贫血小鼠红细胞的影响
• 3.2.1.2 肽 HP-6 对失血性贫血小鼠血红蛋白的影响
• 3.2.1.3 肽 HP-6 对失血性贫血小鼠白细胞的影响
• 3.2.1.4 肽 HP-6 对失血性贫血小鼠血小板的影响
• 3.2.2 肽 HP-6 对环磷酰胺致贫血小鼠模型的影响
• 3.2.3 肽 HP-6 对小鼠生长发育的影响
• 3.2.3.1 肽 HP-6 对小鼠的表观安全性评价
• 3.2.3.2 肽 HP-6 对小鼠体重增长的影响
• 3.2.3.3 肽 HP-6 对小鼠脏器发育的影响
• 3.2.4 肽 HP-6 体内作用小结
• 3.3 驴血清酶解及功能初探
• 3.3.1 驴血清酶解条件初步优化
• 3.3.1.1 预处理温度对驴血清酶解的影响
• 3.3.1.2 初始 pH 对驴血清酶解的影响
• 3.3.1.3 酶使用量对驴血清酶解的影响
• 3.3.1.4 酶解温度对驴血清酶解的影响
• 3.3.1.5 酶解时间对驴血清酶解的影响
• 3.3.2 驴血清酶解物对小鼠骨髓基质细胞增殖的影响
• 3.3.3 驴血清酶解物对小鼠生长发育的影响
• 3.3.3.1 驴血清酶解物对小鼠的表观安全性评价
• 3.3.3.2 驴血清酶解物对小鼠体重增长的影响
• 3.3.3.3 驴血清酶解物对小鼠脏器发育的影响
• 3.3.4 驴血清酶解及功能小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历