论文摘要
1.背景与目的:血管内皮损伤是经皮冠脉介入术（percutaneous coronary intervention, PCI）血管再狭窄及支架内血栓形成的核心[1],也是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等多种血管性疾病共同的病理生理基础[2-4]。内皮的有效再生是抑制血管平滑肌的异常增生和防止血栓形成的关键[5]。因此,尽早促进受损血管再内皮化、恢复内皮功能,俨然是抑制血管损伤不良修复,预防或防治血管再狭窄及血栓形成的有效策略。传统观念认为内皮损伤的修复仅仅依靠邻近内皮细胞的迁移和增殖。近年的大量研究发现内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）是机体促进内皮有效再生以及血管良性修复的重要内在机制[6-9]。现已证明,EPCs在体内微环境的作用下能够分化成有功能的内皮细胞,参与缺血组织的血管新生并整合到损伤血管壁的新生内膜中参与损伤血管的再内皮化[10-13]。然而,目前对于调控EPCs增殖、迁移和分化的机制及某些关键因子在其中的作用尚不完全清楚。CCN1是近年发现的一种分泌型基质信号蛋白[14],广泛参与分化、发育、肿瘤生长等多种病理生理过程的调控[15-18]。已有研究表明:1)胚胎发育过程中CCN1基因缺陷将导致胎盘血管生成减少以及分支障碍,引起胚胎死亡[21]。2)成年后CCN1的表达与血管性疾病如动脉粥样硬化、原发性高血压、肿瘤血管新生等密切相关[22-25];CCN1还参与了皮肤、骨骼、肝脏等多种组织的再生修复过程[26-28]。3)在体外,CCN1能促进大鼠角膜及兔股动脉缺血后的血管新生,并对血管内皮细胞的增殖、迁移及管样形成能力均有促进作用[29-33]。4) CCN1在骨髓间充质干细胞（MSCs）的增殖、分化、迁移中发挥重要调控作用,并诱导CD34+细胞的迁移和归巢[33-35]。提示:CCN1可能在EPCs介导的血管新生及血管损伤修复中发挥重要作用。因此在本课题中,我们将从整体动物和和细胞水平探讨CCN1在EPCs增殖、迁移、分化以及血管损伤修复中的作用及其机制。期望为深入认识CCN1的生物学功能及EPCs的调控机制提供新的实验依据,为进一步促进血管损伤后内皮再生、血管良性修复提供新的思路和策略。2.方法:2.1重组腺病毒Ad-CCN1和Ad-Id1的构建从大鼠组织提取RNA,经RT-PCR扩增得到目的基因CCN1和Id1片段,通过pMD19T-Simple和AdEasy细菌内同源重组系统构建CCN1和Id1的病毒过表达载体,分别命名为Ad-CCN1和Ad-Id1,经过测序、PCR和酶切鉴定重组病毒Ad-CCN1和Ad-Id1的构建。2.2观察CCN1在血管损伤修复过程中的表达及作用用1-2月龄的雄性SD大鼠复制颈动脉球囊损伤模型,通过荧光定量RT-PCR以及Western blot分别观察CCN1在血管损伤修复过程中mRNA和蛋白表达水平的变化;然后向损伤血管组织转染Ad-CCN1,观察过表达CCN1对损伤后4、7、14、21天血管再内皮化以及新生内膜增厚的影响。2.3 CCN1对EPCs增殖、迁移和分化的作用通过密度梯度离心及选择性培养的方法在体外分离、培养大鼠骨髓源EPCs,经过细胞形态学、表面分子标志以及Dil-acLDL/FITC-UEA-I双阳性鉴定后,转染Ad-CCN1以及含CCN1 shRNA的重组质粒pGenesil-CCN1,以观察过表达或沉默CCN1基因对EPCs增殖、迁移、分化的作用。2.4探讨CCN1作用于EPCs增殖、迁移和分化的分子机制2.4.1利用GEArray公司的DNA芯片初步分析Ad-CCN1作用后48小时对EPCs基因表达的影响,筛选CCN1作用的可能下游靶点;2.4.2检测Ad-CCN1作用下负性转录调控因子Id1在转录、蛋白表达水平的变化,并通过Ad-Id1与Ad-CCN1的共转染实验观察Id1对Ad-CCN1诱导的EPCs分化的影响,以明确Id1是否参与介导Ad-CCN1对EPCs分化的调控作用。3.结果:3.1.重组腺病毒Ad-CCN1和Ad-Id1的构建从大鼠组织提取RNA进行RT-PCR获得含酶切位点的CCN1和Id1基因全CDS区,将目的基因连接到pMD19T-Simple载体中扩增,经过酶切、连接、转化等步骤后获得pAdTrack-CCN1和pAdTrack-Id1,然后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,通过筛选、293T细胞包装后获得重组病毒Ad-CCN1和Ad-Id1,经鉴定、扩增获得高滴度的Ad-CCN1和Ad-Id1病毒颗粒用于下一步实验。Ad-CCN1和Ad-Id1的病毒滴度约为1.2×1010 -2.8×1011 pfu/ml。3.2 CCN1在血管损伤修复中的表达及作用3.2.1大鼠颈动脉损伤模型的建立和转染经损伤血管组织切片H&E染色证实,我们成功复制了大鼠颈动脉球囊损伤模型,损伤后7天开始出现镜下可见的内膜增生,21天时新生内膜增生明显。荧光倒置显微镜下可见转染后血管组织切片中有绿色荧光表达,证实在体腺病毒转染是成功有效的,且未发现对实验动物有明显毒副作用。3.2.2 CCN1在血管损伤修复中的表达免疫组化实验显示CCN1在损伤血管的新生内膜、中膜以及外膜组织均有表达。CCN1mRNA在正常血管组织低表达,血管损伤后表达迅速上升,12h即达到高峰,之后逐渐下降,损伤后第21天仍较对照组高。Western blot检测到CCN1蛋白表达在血管损伤后第12h开始上调,24h时达到高峰,然后逐渐回落,在损伤后第14天再次达到一个较低的表达峰值,损伤后第21天仍有表达。3.2.3过表达CCN1对球囊损伤后血管再内皮化的影响通过伊文氏蓝染色观察发现,假手术对照组内皮无损伤,内皮覆盖率为100%,损伤组残留内皮覆盖率为0%,说明内皮剥脱完全。CCN1过表达明显促进第4天、7天和14天时损伤血管的再内皮化,与相同时间点Ad-GFP转染对照组比较均有显著差异（P<0.05）,说明CCN1对损伤血管的再内皮化有促进作用。3.2.4过表达CCN1对球囊损伤后血管内膜增生的影响在血管损伤后第14天,Ad-CCN1转染组血管组织内、中膜比值为0.26±0.12,明显低于Ad-GFP对照组的内、中膜比值0.58±0.18（P<0.01）,而两组中膜面积无明显差异（P>0.05）,提示过表达CCN1抑制了球囊损伤后第14天大鼠颈动脉新生内膜的增厚。在损伤后第21天,CCN1过表达组与GFP对照组比较无明显差异（1.13±0.21 vs 1.20±0.19,P>0.05）,说明损伤后第21天CCN1抑制血管新生内膜增厚的作用不明显。3.3 CCN1对EPCs增殖、迁移和分化的作用3.3.1 EPCs鉴定分离培养的EPCs经过诱导分化后向内皮细胞表型转变,流式细胞检测CD34、CD133及VEGFR-2在培养细胞中的阳性率分别为90.28%、93.86%和74.03%,而造血细胞表面抗原CD45的阳性表达率则十分低（<10%）,Dil-acLDL/FITC- UEA-I双阳性细胞约占90%,说明所培养细胞是EPCs。3.3.2基因转染EPCs转染后细胞状态良好,贴壁生长,无变圆、缩小或脱落等病理迹象,经过荧光倒置显微镜、RT-PCR以及Western blot观察发现Ad-CCN1的转染效率在第24小时约60%,48-72小时达高峰,约80%。pGenesil-CCN1转染后4天, CCN1在EPCs的表达被显著抑制,转染率约50%。3.3.3 Ad-CCN1对EPCs增殖的影响采用MTT法分析发现,Ad-CCN1对EPCs增殖没有显著作用。虽然与Ad-GFP对照组比较,Ad-CCN1对EPCs的增殖有明显促进作用（* P<0.05）,但与未转染对照组比较发现,Ad-CCN1对EPCs增殖的作用没有统计学差异（P>0.05）。3.3.4 Ad-CCN1对EPCs迁移的影响外源性CCN1的过表达显著促进了EPCs的迁移。在Ad-CCN1作用诱导下,平均每个视野中迁移EPCs的数目从7.1±1.8增加到26.1±2.8,增加了近3倍（* P<0.01）。加入CCN1封闭性抗体CCN1-Ab后,Ad-CCN1的作用明显减弱（# P<0.05）,提示EPCs迁移能力的增强是过表达CCN1引起的。3.3.5 Ad-CCN1对EPCs分化的影响Ad-CCN1诱导细胞获得内皮样细胞形态,表现为贴壁伸展、体积增大、呈长梭形或多角形;FACS结果显示,CD34在Ad-CCN1和Ad-GFP两组的阳性表达率分别是13.83±5.23%、59.79±9.61% , VE-cadherin的阳性表达率分别是85.74±7.11%、14.04±6.28%;Dil-acLDL阳性细胞数在Ad-CCN1组为93.5±6.3%,明显高于Ad-GFP组的61.3±9.2%。3.3.6利用RNA干扰沉默CCN1对EPCs增殖、迁移和分化的作用结果表明pGenesil-CCN1介导的CCN1基因的沉默明显抑制了EPCs的增殖、迁移和分化功能,与未干预组及pGenesil空质粒对照组比较均有显著差异（* p<0.05）。3.4 CCN1作用于EPCs的分子机制探讨3.4.1 CCN1对EPCs基因表达的影响Ad-CCN1作用后48小时,EPCs中有8个基因明显上调2倍以上,包括4个生长因子（受体）Ereg、Vegf-c、Igf-1、和Kdr,2个基质相关分子Itgav和Timp2,1个细胞因子Tnf和1个信号蛋白Gna13;此外,12个基因的表达在CCN1作用下明显下调（2倍以上）,也主要是生长因子和基质分子两大类相关基因,包括Vegf-b、Tgfa、Tgfb1、Mdk、Ptn、Thbs2、Timp3、plau（u-PA）、Ifn-a1、Cxcl5、Akt1以及Sh2d2a。3.4.2 Id1对CCN1促EPCs分化作用的影响通过荧光定量RT-PCR及Western blot检测发现Ad-CCN1显著降低了Id1在EPCs中的表达,p<0.05。单独转染Ad-Id1对EPCs分化无显著影响,与Ad-CCN1的共转染则显著抑制了Ad-CCN1对EPCs分化的促进作用,p<0.05,提示Id1抑制了CCN1对EPCs分化的促进作用。4.结论:4.1 CCN1在球囊损伤的大鼠颈动脉组织动态高表达;过表达CCN1显著促进大鼠球囊损伤早期血管再内皮化程度;过表达CCN1抑制大鼠球囊损伤第14天血管新生内膜的增厚;4.2过表达CCN1基因促进EPCs的迁移和分化;沉默CCN1基因抑制EPCs的增殖、迁移和分化;4.3过表达CCN1诱导EPCs中20个基因表达的显著变化;4.4过表达CCN1抑制Id1在EPCs的表达;Id1至少部分抑制CCN1对EPCs分化的促进作用。