论文摘要
目的：观察胎儿毛囊黑素细胞的定位及电子显微镜下超微结构。体外分离培养人毛囊黑素细胞，研究三种人工合成寡核苷酸序列（CpG-oligodeoxynucleotide, CpG-ODN）对胎儿毛囊黑素细胞（human follicle melanocytes, HFM）酪氨酸酶活性及其形态的影响。为白癜风的治疗提供新思路，同时部分阐明炎症后色素沉着的机制。方法：获取胎儿头皮（畸形引产，已死亡），此标本由×××××第一附属医院妇产科提供。根据孕龄及胎儿头顶径，标本取自120天到180天之间的胎儿头皮。分别进行免疫组化、免疫荧光、电子显微镜以及体外培养研究。（1）免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶法。黑素细胞的特异性标记抗体NKI/beteb及HMB-45染色：制备冰冻切片，冷丙酮固定，3%H2O2封闭，一抗室温下孵育1小时，加辣根酶标记羊抗鼠IgG孵育30分钟。（2）免疫荧光：所用标本为4μm冰冻切片。10%的福尔马林固定，5%牛血清白蛋白封闭，一抗4°C孵育过夜，然后与异硫氰酸荧光素标记的二抗孵育。一抗分别为：鼠抗NKI/beteb,鼠抗HMB-45,鼠抗CD34。（3）透射电子显微镜观察：2.5%戊二醛固定标本2-4小时, PBS浸洗,1%四氧化锇固定30分钟。1%乙酸双氧铀处理1小时。系列浓度乙醇脱水、包埋、70nm超薄切片,硝酸铅、醋酸铅及枸橼酸铅染色。JEM-1010型透射电子显微镜下观察。（4）流式细胞仪检测：标本无菌处理，胶原酶Ⅱ消化头皮，游离毛囊，0.25%胰酶/EDTA消化毛囊，制备单细胞悬液。分别加入含荧光素标记的双抗体：CD34-PE/CD3-APC和CD34-PE/CD45-perCP，流式细胞仪检测。（5）体外培养：用胶原酶和胰酶两步消化法分离培养毛囊黑素细胞。用不同的CpG-ODN（CPG2006, CPG1668和CPG1826）处理培养的胎儿毛囊黑素细胞，观察酪氨酸酶活性及细胞形态变化。多巴氧化法测定酪氨酸酶活性，硝酸银染色后倒置显微镜观察细胞形态变化。结果：（1）NKI/beteb主要表达在胎儿头皮的毛囊外根鞘隆突区，也见于表皮基底部。HMB-45主要表达在毛球、毛母质和表皮基底部，外根鞘区表达阴性。（2）CD34主要表达于胎儿头皮的毛囊外根鞘隆突区,也见于毛球处、表皮基底部；流式细胞仪检测出CD34阳性占毛囊总数的8.54%～13.04%。（3）位于头皮内的黑素细胞胞浆明亮，核异染色质。这些细胞含有不同时期的黑素小题，大部分是未成熟黑素体。可以明显看到黑素体转运至邻近角质形成细胞内。黑素细胞还位于发育中的毛囊，例如外根鞘（outer root sheath,ORS）。其树突较少，含有大量未成熟黑素小体。在本研究中我们还观察到，在角质形成细胞内存在聚集的，降解的黑素体。这些黑素体位于吞噬泡内，在角质形成细胞内没有看到单个游离的黑素细胞或前黑素体。（4）CpG-2006和CpG-1826组，细胞的胞体变得肥大，黑素化明显，树突增多，与对照组相比有显著差异。CpG2006、CpG1826、CpG1668对细胞酪氨酸酶具有显著的促进作用（P <0.05）。结论：（1）黑素细胞存在于毛囊的不同部位，毛囊的外根鞘中存在未成熟的黑素细胞，而毛球和表皮基底部存在成熟的黑素细胞。（2）胎儿头皮毛囊隆突区有较多的CD34阳性细胞，推测该部位为毛囊干细胞的居处。CD34阳性占毛囊总数的8.54%～13.04%。（3）胎儿毛囊内黑素细胞超微结构不同于表皮黑素细胞,这种结构显示原始细胞的特性,可能是黑素干细胞。（4）部分人工合成寡核苷酸序列可促进毛囊黑素细胞的酪氨酸酶活性和树突增加，为白癜风皮损复色的研究奠定基础。
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- [1].三种人工合成寡核苷酸序列对体外培养的毛囊黑素细胞的影响[J]. 中国美容医学 2011(01)