论文摘要
冠心病是严重危害人类健康的一类疾病,从中医学的角度来讲,冠心病属于“胸痹”、“心痛”的范畴,而血瘀证是冠心病中最为常见的类型。蛋白质作为基因的最终产物及细胞中的活性大分子,利用其研究心血管疾病将会更完整地提示代谢调控以及严重疾病的规律性；在中医领域中则可为中医辨证提供其生物学背景和客观依据。目的：建立血清双向凝胶电泳较稳定的实验条件,比较冠心病不同阶段之间及冠心病血瘀证患者和正常人之间血清蛋白质表达的差异,寻找与冠心病及冠心病血瘀证相关的特异蛋白质,探讨冠心病的发生发展机制以及冠心病血瘀证的分子生物学本质,同时观察冠心病各期血清对脐静脉血管内皮细胞增殖的影响作用。方法：1冠心病不同阶段血清及血瘀证的蛋白质组学研究1.1严格按照纳入标准和排除标准收集4期病例,选择冠心病各阶段患者各8例,其中④组冠心病患者中医辨证均为血瘀证,清晨采集各组人群外周静脉血各3ml,离心获得各组的血清样本。1.2 Brandford法测定血清总蛋白浓度,然后对冠心病4组血清进行双向凝胶电泳分离。第一向等点聚焦.（IEF）电泳在IPGphor等点聚焦仪中进行,上样量为1mg,选择pH范围3-10NL、长度24cm的IPG干胶条；然后经过两步各15分钟的平衡,将胶条转移到12%浓度、25.5cmx20.5cmxlmm大小的SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上；考马斯亮兰染色,凝胶经扫描后用Imagemaster和PDQuest软件对两组凝胶图像进行匹配、分析,找出两组间的差异点。从凝胶上切取差异点,经胰蛋白酶水解,进行MOLDI-TOF-MS检测,所得蛋白质点信息通过Mascot软件搜索Swissprot和NCBInr数据库,对蛋白质进行鉴定。2冠心病各期血清对HUVEC的影响2.1复苏后的脐静脉血管内皮细胞,以10%胎牛血清（FBS）培养基培养于37℃、5%C02浓度的温箱中培养。2.2按3000个细胞/孔接种于96孔板中,将4组血清分别经0.22um滤膜过滤除菌后,与DMEM培养液按比例混合为5%的血清DMEM培养液,分别将各组血清加入96孔板中,每组至少6个复孔2.3分别在培养至24h、48h、72h、96h时,MTT法检测各孔490nm处的吸光度值（OD值）。结果：1冠心病不同阶段血清及血瘀证的蛋白质组学研究1.1获取①正常健康组、②冠心病中高危人群组、③冠心病急性期患者组和④冠心病稳定期患者组的平均蛋白质点数分别为153.6±27.57、148.8±23.15、120.8±6.57、146.6±19.99。1.2通过分析比较,得到四组间的差异蛋白质点13个,经肽质量指纹谱鉴定,查询数据库,最后得到7个有意义的蛋白质点,分别为：视黄醇结合蛋白4（RBP4）、载脂蛋白E（ApoE）,载脂蛋白A1（ApoA1）、CD5抗原样蛋白（CD 5L）、结合珠蛋白（H p）、簇连蛋白（CLU）以及血清白蛋白（ALB）。1.3通过分析比较冠心病血瘀证组与正常人血清蛋白表达的差异,有6个蛋白质存在差异：RBP4、ApoE、ApoA1、CD5L、Hp、ALB、2冠心病各期血清对HUVEC的影响不论是在四组血清中加或不加5%胎牛血清,四组血清对脐静脉血管内皮细胞增殖的影响作用趋势是一致的：①、②、③、④组血清对HUVEC的促增殖作用呈逐渐增强的趋势,④组的促增殖作用最强。结论：1建立了重复性好、较稳定的血清双向凝胶电泳的实验条件,并获得了较好的冠心病各组血清蛋白质表达图谱。2发现了视黄醇结合蛋白4（RBP4）、载脂蛋白E（ApoE）、载脂蛋白A1（ApoA1）、CD5抗原样蛋白（CD5L）、结合珠蛋白（Hp）、簇连蛋白（CLU）以及血清白蛋白（ALB）7种与冠心病相关的差异蛋白质,其中有6种与冠心病血瘀证相关认为血瘀证的发生可能与炎症反应和脂质代谢紊乱相关,但仍待进一步验证。3四组血清对HUVEC的粗增殖作用呈逐渐增强的趋势,认为冠心病患者血清中可能含有某些促进血管内皮细胞再生的细胞因子或蛋白质组分,促进缺血发生时侧枝循环血管的建立