PPARγ激动剂吡格列酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制研究

论文摘要

在工业化国家,缺血性心脏病是主要的死亡原因。目前针对冠心病的主要治疗手段,包括溶栓、介入治疗、冠状动脉搭桥手术等,均是对缺血心肌实施再灌注,而再灌注也会造成心肌细胞的损伤。缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）损伤成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题。既往研究表明,各种不同的PPARγ（peroxisomeproliferator-activated receptor-γ,过氧化物酶体增殖物激活受体γ）激动剂（包括罗格列酮、曲格列酮和吡格列酮等）都可以减少心肌缺血再灌注损伤,发挥类似IPC（ischemia preconditioning,缺血预处理）的作用,并对其机制作了一定的研究。本研究利用原代培养的大鼠心肌细胞、急性分离的大鼠心肌细胞及成年大鼠,在既往研究的基础上进一步探讨PPARγ激动剂吡格列酮预处理抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制。1.目的1.1.观察KATP（ATP-sensitive potassium channel,ATP敏感性钾通道）在吡格列酮抗大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用;1.2.观察吡格列酮对急性分离大鼠心室肌细胞KATP电流的影响;1.3.观察在大鼠心肌缺血再灌注损伤时心肌ERK1/2、磷酸化ERK1/2、p38、磷酸化p38、TGFβ1、COX-2及HIF-1α表达的变化及吡格列酮对其影响。2.方法2.1.利用原代培养的新生SD（sprague-Dawley）大鼠心肌细胞,分别予以0.1、1.0、2.0μM浓度吡格列酮预处理24h,同时分别予以特异性PPARγ受体阻断剂GW9662、sarcKATP（sarcolemmal ATP-sensitive potassiumchannel,肌膜ATP敏感性钾通道）阻断剂HMR-1098和mitoKATP（mitochondria ATP-sensitive potassium channel,线粒体敏感性钾通道）阻断剂5-HD（5-Hydro-xydecanoate,5-羟葵酸）处理后,建立缺氧复氧模型,Annexin V-FITC/PI双染法及Hoechst33258染色法检测心肌细胞凋亡;收集心肌细胞,利用免疫印迹方法、RT-PCR方法检测两种KATP亚单位Kir（inwardly rectifying K channel,内向整流钾通道）的表达。2.2.急性分离成年SD大鼠心肌细胞,细胞缺氧后记录KATP电流,观察不同浓度吡格列酮灌流细胞后对电流的影响;2.3.成年SD大鼠30只,分组后分别予以5、10、20mg·kg-1·d-13种浓度吡格列酮灌胃×7d,灌胃后在体建立心肌缺血再灌注损伤模型:结扎冠状动脉前降支30min,复灌30min,留取心肌组织,利用免疫印迹方法、RT-PCR方法检测ERK1/2、磷酸化ERK1/2、p38、磷酸化p38、TGFβ1、COX-2及HIF-1α表达的变化及吡格列酮对其影响。3.结果3.1.缺氧复氧后心肌细胞早期凋亡率升高（由空白组的0.20±0.03%增加至12.22±1.45%,P＜0.05）,吡格列酮减少心肌细胞凋亡（各剂量组分别为10.09±0.67%、9.16±1.47%、8.32±0.89%）,仅2.0μM组与缺氧复氧组比较有统计学差异（P＜0.05）。PPARγ受体阻断剂GW9662阻断2.0μM吡格列酮抗心肌细胞凋亡的作用（12.46±1.62%,P＜0.05）;3.2.mitoKATP阻断剂5-HD削弱吡格列酮抗心肌细胞凋亡的作用（凋亡率10.00±0.50%,P＜0.05）,sarcKATP阻断剂HMR-1098无明显影响（8.74±1.59%,P＞0.05）;3.3.吡格列酮上调mitoKATP亚单位Kir6.1 mRNA及蛋白的表达,PPARγ受体阻断剂GW9662削弱这种上调作用;吡格列酮对sarcKATP亚单位Kir6.2 mRNA表达无明显影响;3.4.在急性分离成年SD大鼠心肌细胞,细胞缺氧后成功诱发出ATP敏感性钾电流,不同浓度吡格列酮灌流细胞后对电流无明显影响;3.5.缺血再灌注后,大鼠心肌ERK1/2、p38蛋白表达无明显变化,磷酸化ERK1/2、磷酸化p38、TGFβ1、COX-2、HIF-1α表达上调;吡格列酮对ERK1/2表达无明显影响,上调磷酸化ERK1/2表达;对p38表达无明显影响,下调磷酸化p38的表达;上调TGFβ1mRNA、蛋白表达;上调COX-2 mRNA、蛋白表达;上调HIF-1αmRNA表达。4.结论4.1.吡格列酮预处理减轻心肌细胞缺氧复氧后凋亡,这种作用部分通过激活PPARγ途径实现;4.2.吡格列酮可能通过上调mitoKATP通道亚单位表达、诱导mitoKATP开放发挥抗心肌细胞凋亡作用,sarcKATP未参与这种保护过程;4.3.吡格列酮抗心肌缺血再灌注损伤可能与调节RISK（Reperfusion InjurySalvage Kinase,再灌注损伤救援激酶）的表达有关。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 吡格列酮对缺氧复氧大鼠心肌细胞的保护作用及阻断ATP敏感性钾通道的影响
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 第二部分 吡格列酮对缺氧诱发的大鼠心室肌细胞ATP敏感性钾电流的影响
• 材料与方法
• 结果
• 第三部分 吡格列酮对大鼠在体心肌缺血再灌注损伤的保护作用及分子机制
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 文献综述
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢