灵芝深层发酵水溶性活性物质的研究

论文摘要

本论文主要对灵芝深层发酵蛋白酶A抑制剂的分离纯化、基本特性、结构与功能的关系、产生的基本条件、纯生啤酒中的应用等方面进行了研究。灵芝深层发酵水溶性活性物质初步分离研究发现:灵芝深层发酵也能产生SOD,且菌丝体中的含量明显高于发酵液,4℃半衰期为7d,相对表观分子量为35000。灵芝发酵全粉抽提液中分离得两种蛋白酶A抑制剂GLPIA1和GLPIA2,建立的纯化工艺为:乙醇分级沉淀（30～80%）、Ultrogel AcA44凝胶层析、Source 30Q离子交换层析。SDS-PAGE和凝胶过滤测定GLPIA1相对表观分子量为38000;GLPIA1的热稳定性较高,80℃保温30分钟,仍保留95%以上的活性,98℃也仅丢失约9%的抑制活性;GLPIA1的pH稳定范围为3.0～7.5; GLPIA1对几种蛋白酶都表现出一定的抑制作用,且对两种天冬氨酸族蛋白酶有相对较高的抑制活性;GLPIA1对蛋白酶A作用时,Ki值为2.2×10-6,抑制效果最强,其次是胃蛋白酶,GLPIA1对蛋白酶A的IC50为0.16mg/ml;动力学研究（Lineweaver-Burk作图法）发现,GLPIA1是蛋白酶A的非竞争性抑制剂。蛋白酶A抑制剂被两种蛋白酶协同水解或被β-1,3葡聚糖酶水解后,抑制作用都出现大幅度的下降,说明GLPAI1肽链或糖链部分发生降解对其抑制活性有较大影响;GLPIA1中亚氨基酸（脯氨酸）和酸性氨基酸的含量相对较多（分别接近11%和27%）;气相色谱分析GLPIA1糖链组成中含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖四种单糖,其中葡萄糖的含量为96%;β-消去反应前后的紫外扫描和氨基酸组成比较结果表明:GLPIA1中的糖苷键为O型糖苷键。GLPIA1的红外吸收图谱及核磁共振图谱结果说明:GLPIA1是一个典型的多糖与蛋白质的复合物,多糖中含有β糖苷键;GLPIA1侧链存在少量β1,6-糖苷键,结合红外与气相的结果,推测此糖蛋白的糖链主要由β-D-葡萄糖以β-1,3糖苷键相连,存在极少量的分支,分支点为β1,6-糖苷键。据GLPIA1与刚果红复合物及单纯刚果红溶液在不同NaOH浓度下λmax的变化,得出GLPIA1分子存在三股螺旋构象;不同浓度碱处理又中和透析过的GLPIA1在不同浓度下进行蛋白酶A抑制活性分析,抑制活性的变化与糖链构象变化相对应,证实GLPIA1空间结构与其抑制活性存在密切关系。灵芝发酵全粉抽提液中另一种蛋白酶抑制剂GLPIA2,仅在215有紫外吸收;GLPIA2的酸性氨基酸较高,三种芳香族氨基酸Trp,Phe和Tyr的含量很低。SDS-PAGE测定其相对表观分子量为15000;GLPIA2对胃蛋白酶和酵母蛋白酶A的抑制作用相对较强,比抑制活力分别为14.96 u/mg与10.84u/mg;抑制剂对胃蛋白酶和蛋白酶A的Ki分别为1.52×10-7mol/L和1.34×10-6mol/L;GLPIA2对胃蛋白酶的半抑制浓度IC50值为0.18mg/ml,对蛋白酶A的半抑制浓度IC50值0.29 mg/ml;GLPIA2是胃蛋白酶和蛋白酶

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 国内外研究动态及发展趋势
• 1.3 立题意义
• 1.4 本论文主要研究内容
• 1.5 参考文献
• 第二章 灵芝深层发酵水溶性活性物质初筛
• 2.0 前言
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.3 本章小结
• 2.4 参考文献
• 第三章 灵芝发酵全粉蛋白酶A 抑制剂的提取及基本特性
• 3.0 前言
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.3 本章小结
• 3.4 参考文献
• 第四章 GLPIA1 的结构及其与功能的关系
• 4.0 前言
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.3 本章小结
• 4.4 参考文献
• 第五章 蛋白酶抑制剂GLPIA2 与GLPIB 的基本特性
• 5.0 前言
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.3 本章小结
• 5.4 参考文献
• 第六章 灵芝发酵全粉蛋白酶A 抑制剂产生条件初探
• 6.0 前言
• 6.1 材料与方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.3 本章小结
• 6.4 参考文献
• 第七章 灵芝发酵全粉蛋白酶 A 抑制剂的应用探讨
• 7.0 前言
• 7.1 材料与方法
• 7.2 结果与讨论
• 7.3 本章小结
• 7.4 参考文献
• 主要结论
• 主要创新点
• 致谢
• 附录