亚低温联合促红细胞生成素（EPO）对颅脑创伤后β-淀粉样蛋白（Aβ）表达影响的体内体外研究

论文摘要

目的：拟通过检测p-淀粉样蛋白（Aβ）在临床颅脑创伤（TBI）患者体液中表达量的改变,证实其参与TBI的进展；构建pIRES2-EGFP-APP重组表达质粒,转染SH-SY5Y-APP细胞,构建稳定表达Aβ的细胞模型,采用亚低温干预手段,证实该措施对细胞创伤起一定程度的保护作用；在此基础上回归体内试验,常规建立液压颅颅脑创伤模型,除给予亚低温保护性干预外,应用促红细胞生成素（EPO）及其与亚低温联合干预,观察治疗效果,寻找颅脑创伤的新的治疗靶点,为临床早期干预寻找新的方向。方法：本课题分为三部份,第一部分：通过对60例小样本的临床病例进行检测,分别于患者入院后第0h、24h、48h、72h留取CSF、外周血,ELISA方法检测Aβ含量,并采用GCS评分标准判断预后评估,检测Aβ在脑脊液及血清中的变化与预后的相关性。第二部分：构建pIRES2-EGFP-APP重组表达载体,常规培养SH-SY5Y细胞系,细胞状态稳定后进行转染,western-blot方法检测细胞蛋白中APP是否表达及表达量高低,构建稳定表达APP的细胞模型；并在此基础上给予常温及亚低温培养,检测不同温度条件下细胞生长情况。第三部分：制备液压颅颅脑创伤模型,大鼠造模结束后采用冰袋包裹头部以下部位,30分钟内将体温降至31℃保持温度波动于31-33℃,5小时；其后将体温升至37.5-38.5℃。rhEPO组大鼠致伤后即刻及每天腹腔内注射（5000IU/kg） rhEPO,术后每12h肌注青霉素钠40万U。分别于手术后0.5h、2h、6h、12h、24h、48h、72h, ELISA方法检测血清及脑脊液中Aβ含量,病理检查观察TBI模型脑组织创伤情况,western-blot检测不同干预方式脑组织中Ap表达。结果：第一部分实验通过对小样本的临床病例的体液标本进行检测,发现颅脑创伤患者术后Aβ随时间改变逐步升高,其机制涉及颅颅脑创伤可致神经元、胶质细胞创伤,血脑屏障破坏,进而使得崩解的细胞骨架中的Aβ进入脑脊液及血液循环,其表达水平与创伤程度呈正相关。第二部分的研究结合临床检验的结果,选用真核表达载体pIRES2-EGFP来转染SH-SY5Y细胞系,基于细胞标记示踪理论依据,并借助该实验手段对细胞株进行反复筛选,从而获得稳定转染并大量表达APP的细胞系。通过Western-blot进一步证明了APP基因在转染细胞系内稳定表达。并给予细胞株常温培养及亚低温培养两种不同的干预措施,证实亚低温对细胞创伤起一定程度的保护作用。第三部分进行了体内模型的构建和研究,成功构建了大鼠液压冲击颅颅脑创伤模型,通过神经系统评分鉴定了模型的可行性,在此基础上分别给予亚低温、EPO、及两者联合干预治疗的方式,证实亚低温联合EPO可有效保护颅脑创伤后大脑功能的改变,为进一步深入展开创伤性颅脑的治疗提供新的治疗靶点及理论依据。结论：在常规治疗的同时,采用亚低温治疗可抑制重型颅颅脑创伤患者的Aβ的表达及ICP水平并提高患者预后,Aβ作为一种新生物标记物,其动态变化与颅颅脑创伤创伤程度有一定相关性,Aβ含量变化作为患者预后一项评定指标。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、Aβ在颅脑创伤后患者脑脊液及血液中的定量检测及其与临床预后的相关性研究
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 主要材料
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 颅脑创伤后血清中Aβ表达量的变化及ICP评分
• 1.2.2 颅脑创伤后不同时间点GCS评分
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、pIRES2-EGFP-APP重组表达载体及SH-SY5Y-APP细胞系构建
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器与耗材
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果
• （―）、PIRES2-EGFP-APP重组表达载体构建情况
• （二）、SH-SY5Y-APP细胞系构建及生长情况
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、亚低温联合促红细胞生成素治疗TBI动物模型构建及其aβ变化规律
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 方法
• 3.2 结果
• 1. 造模结果
• 2. 动物模型大体观察
• 3. 神经系统功能评分
• 4. HE染色结果
• 5. 不同干预方式对AP表达的影响
• 6. 不同干预方式对A(3表达的影响（ELISA）
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢