有丝分裂期Mps1-Aurora B调控通路的分子机制解析

论文摘要

在细胞分裂的过程中,细胞如何将父代的遗传信息均等准确的传递到子代细胞中存在着精确地调节。纺锤体微管与染色体上动点之间的动态连接保证了染色体在赤道板上的精确排列。而纺锤体检验点可以防止在动点和微管连接出现异常时,染色体发生提前分离。但对于动点微管连接的调控机制和纺锤体检验点是如何感知微管动点异常连接,仍然存在着未知领域。为此,我的研究主要是围绕纺锤体微管-动点连接的调控机制和纺锤体组装检验点的启动机制。之前的研究表明,Mps1是一个纺锤体检验点信号通路中上游的激活因子,但是,Mps1如何感知动点和微管连接的不稳定至今尚未阐明。在本文中,我们阐明了Aurora B是通过磷酸化Hee1的N-tail （1-80aa）来增强Mps1动点定位信号,从而将动点与微管的异常连接转化为纺锤体检验点（SAC）的初始信号。体外Pull down实验证明Mps1的1-303aa可以与Hee1的CH domain （1-196aa）发生直接的相互作用。同时体内免疫荧光表明,缺失了Heel CH domain会导致Mps1失去动点定位,与前面的生化结果相互印证。利用Aurora B的小分子抑制剂（ZM449439）处理细胞发现,Aurora B激酶活性被抑制时,Mps1的动点定位减弱,提示我们Aurora B可能是通过磷酸化Hee1N-tail上9个位点调节Mps1与Hee1的结合强度。令人兴奋的是,我们使用Hee1模拟磷酸化／非磷酸化的突变体Hec19D/9A证实了这一猜想。通过免疫荧光实验我们发现,在转染了Hec19D的细胞,Mps1的动点定位增强,并且这种增强不受ZM447439的影响。综合上述实验结果,我们认为在动点微管连接异常时,Aurora B对Heel N-tail进行磷酸化,磷酸化的Heel N-tail有助于Mps1与Heel CH domain的结合,从而招募大量的Mps1定位到动点,起始SAC其他组分的动点定位。当微管动点建立双极定向连接之后,内层着丝粒与外层动点的距离增大,Aurora B不能磷酸化Hec1N-tail,导致Hee1对Mps1的结合能力降低,动点上没有足够量的Mps1对SAC其他组分进行招募,从而导致SAC失活。Histone甲基化修饰在DNA复制,基因转录,异染色质的形成和染色质凝集等方面起了重要的作用。但在,对于着丝粒上甲基化水平如何参与调控染色体分离的过程,目前并不是十分明确。我们设计了一种基于FRET原理的分子探针来监测SUV39H1在着丝粒上甲基化转移酶活性的变化,结果发现在染色体分离过程中着丝粒上甲基化水平存在着时空动态性。如果使用SUV39H1小分子抑制剂抑制SUV39H1的酶活性会导致染色体列队发生异常,反映了在染色体在赤道板上动态排列的过程中,SUV39H1的活性是不可缺少的。同时我们还发现,抑制了SUV39H1的活性会导致Aurora B激酶活性的增高,使得MCAK在动点的定位增多,从而使得未排列好的动点与微管连接的不稳定性增加。综上所述,我们认为SUV39H1在着丝粒上形成一个渐变的甲基化信号,为染色体在有丝分裂期准确排列提供了必不可少的时空信息,形成一条甲基化／磷酸化时空协作的调控通路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 有丝分裂研究概述
• 1.2.1 有丝分裂的基本过程
• 1.2.2 生物光子学在有丝分裂研究中的应用
• 1.2.3 化学小分子在有丝分裂研究中的应用
• 1.3 动点-微管连接与确保染色体正确分离的机制
• 1.3.1 动点的结构与功能概述
• 1.3.2 动点位置的确定
• 1.3.3 动点的组装
• 1.3.4 动点-微管结合的分子基础
• 1.3.5 染色体双极定向的建立和调控
• 1.3.6 错误连接的产生和纠正
• 1.4 纺锤体检验点
• 1.4.1 SAC的分子基础
• 1.4.2 MCC的组装机制
• 1.4.3 SAC的起始
• 1.4.4 SAC的失活
• 1.4.5 SAC的激酶的功能
• 1.5 Mps1激酶在有丝分裂期的功能
• 1.5.1 Mps1在有丝分裂期的定位
• 1.5.2 Mps1在有丝分裂期的功能
• 1.5.3 Mps1的结构解析
• 1.5.4 针对Mps1的小分子抑制剂研究
• 1.6 组蛋白的翻译后修饰（Post-translational modification, PTM）对有丝分裂的影响
• 1.6.1 磷酸化（Phosphorylation）
• 1.6.2 甲基化（Methylation）
• 1.6.3 乙酰化（Acetylation）
• 1.6.4 泛素化（Ubiquitinylation）
• 1.6.5 Histone翻译后修饰之间的Crosstalk
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 载体
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 细胞株
• 2.1.4 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 分子克隆
• 2.2.2 体外生化实验
• 2.2.3 细胞学相关实验
• 第3章 实验结果和讨论
• 3.1 Mps1在SAC中负责感受动点微管连接状态,生成SAC初始信号
• 3.1.1 引言
• 3.1.2 Mps1的动点定位主要依赖于N端1-303aa
• 3.1.3 Hec1 CH domain负责了Mps1的动点招募
• 3.1.4 Aurora B通过磷酸化Hecl N-tail调节Hec1对Mps1的招募
• 3.1.5 Hec1突变体不影响Aurora B着丝粒定位的强度与Aurora B的活性
• 3.1.6 Hec1突变体对Mpsl的招募不受微管和动点之间张力存在与否的调节
• 3.1.7 Hec1 9D对Mad2的招募不受Aurora B活性影响
• 3.1.8 Mps1是SAC中感受动点微管连接异常的起始因子
• 3.1.9 讨论与展望：有丝分裂过程中Aurora B与Mps1激酶级联激活SAC
• 3.2 SUV39H1调控着丝粒甲基化的时间动态变化确保了染色体正确分离
• 3.2.1 引言
• 3.2.2 MARC可以实时反应着丝粒上甲基化水平的变化
• 3.2.3 在活细胞中使用MARC测量有丝分裂期着丝点三甲基化的变化
• 3.2.4 SUV39H1的活性是正常的有丝分裂进程所必须的
• 3.2.5 抑制动点上SUV39H1的活性导致Aurora B激酶活性的增高
• 3.2.6 SUV39H1通过调节动点的可塑性介导精确的染色体分离
• 3.2.7 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果