线虫fat-1基因在家兔胎儿成纤维细胞中的表达研究

论文摘要

fat-1基因编码ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,可以将多不饱和脂肪酸从ω-6形式转化为ω-3形式。ω-3多不饱和脂肪酸作为细胞构成的重要成分,一直以来受到人们的广泛关注。研究表明,哺乳动物体内一定的ω-3多不饱和脂肪酸含量,可以起到预防心血管疾病、神经退行性疾病甚至癌症的作用。但ω-3多不饱和脂肪酸在大多数动物体内不能合成,只能从食物中摄取。研究人员利用转基因的方法制备了能够表达fat-ι基因的转基因动物,如小鼠、猪等,为研究ω-3多不饱和脂肪酸的功能提供了高效、准确的医学、营养学动物模型。随着人们对ω-3多不饱和脂肪酸认识的增加,对富含这一成分的食品需求也将大大增加,fat-1基因在生产特殊农产品方面也具有十分大的潜力,亟待我们开发利用。本研究根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的秀丽隐杆线虫fat-1cDNA序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因（命名为opfat-1）;从秀丽隐杆线虫中RT-PCR扩增获得fat-1 cDNA。将扩增的fat-1cDNA和合成的opfat-1基因分别构建到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中。采用脂质体Lipofectamine转染法将fat-1cDNA和opfat-1基因转入家兔胎儿成纤维细胞中。对比不同DNA和转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间探讨影响家兔胎儿成纤维细胞转染效率的参数,通过绿色荧光标记、PCR和RT-PCR检测转染细胞中融合蛋白和目的基因的表达。结果表明：经过优化,最优的家兔胎儿成纤维细胞转染条件为：Lipofectamine用量为2-3μl,DNA量为0.8～1.0μg, Lipofectamine与DNA、细胞共培养时间为8h。荧光标记表明,密码子优化的opfat-1与fat-1 cDNA相比,体外瞬时表达效率有极为显著的提高；G418抗性筛选获得转基因单克隆细胞,PCR、RT-PCR初步验证fat-1 cDNA和opfat-1基因均在家兔胎儿成纤维细胞中稳定转录表达。作为阶段性成果,本研究的结果为进一步证fat-1基因功能性蛋白的表达及转fat-1基因克隆家兔的研究奠定坚实基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 前言
• 1 FAT-1基因简介
• 1.1 fat-1基因结构与来源
• 1.2 fat-1基因编码的ω-3PUFAs脱氢酶
• 1.3 ω-3PUFAs的研究
• 1.3.1 ω-3PUFAs的研究背景
• 1.3.2 ω-3PUFAs分类及其来源
• 1.3.3 ω-3PUFAs的生物学功能
• 1.3.4 在癌症方面的应用
• 1.3.5 在心血管疾病方面的应用
• 1.3.6 在神经系统方面的应用
• 1.3.7 在视力、炎症等其它疾病方面的应用
• 1.3.8 在营养方面的应用
• 1.3.9 展望
• 2 外源基因真核表达体系的研究
• 2.1 表达载体
• 2.2 真核表达体系
• 2.2.1 酵母表达系统
• 2.2.2 昆虫杆状病毒表达系统
• 2.2.3 哺乳动物细胞表达系统
• 3 转基因动物的研究
• 3.1 体细胞核移植技术在转基因动物中的应用
• 3.2 转基因动物的应用
• 3.2.1 农牧业领域
• 3.2.2 医学领域
• 3.2.3 作为动物生物反应器
• 3.2.4 动物保护
• 3.3 绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用
• 4 本课题研究的目的和意义
• 第二章 fat-1基因的克隆与序列分析
• 1 克隆策略
• 2 实验材料
• 2.1 实验动物
• 2.2 菌株和载体
• 2.3 主要试剂和工具酶
• 2.4 DNA分析软件及数据库
• 2.5 主要溶液的配制
• 2.6 仪器设备
• 3 实验方法
• 3.1 引物设计与合成
• 3.2 秀丽隐杆线虫总RNA提取
• 3.3 秀丽隐杆线虫fat-1基因第一链cDNA的合成
• 3.4 秀丽隐杆线虫fat-1基因的PCR扩增
• 3.5 秀丽隐杆线虫fat-1基因的优化与合成
• 3.6 琼脂糖凝胶电泳
• 3.7 目的片段的回收纯化
• 3.8 DNA片段与载体连接
• 2法）'>3.9 大肠杆菌感受态细胞制备（CaCl₂法）
• 3.10 热激转化
• 3.11 重组质粒筛选
• 3.12 菌液PCR筛选阳性克隆
• 3.13 质粒DNA的小量提取
• 3.14 克隆载体的酶切鉴定
• 3.15 DNA测序鉴定
• 3.16 菌种的保存于复苏
• 4 实验结果
• 4.1 秀丽隐杆线虫fat-1基因的优化与合成
• 4.2 C.elegans总RNA的电泳结果
• 4.3 fat-1基因的RT-PCR扩增结果
• 4.4 菌液PCR筛选阳性结果
• 4.5 克隆质粒pGEM-fat-1和pUC-opfat-1的双酶切鉴定
• 4.6 克隆质粒序列测定结果
• 5 讨论
• 5.1 目的基因的选择和优化
• 5.2 特异性引物的设计
• 5.3 阳性克隆的筛选与鉴定
• 5.4 fat-1基因的PCR扩增、连接、酶切与测序结果
• 第三章 fat-1基因家兔表达载体的构建
• 1 表达载体PEGFP-FAT-1构建示意图
• 2 实验材料
• 2.1 质粒和菌种
• 2.2 主要试剂和工具酶
• 2.3 DNA分析软件及数据库
• 2.4 主要溶液的配制
• 2.5 仪器设备
• 3 实验方法
• 3.1 引物合成
• 3.2 DNA的常规操作
• 3.3 氯化镁法转化绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1
• 3.4 质粒抽提筛选阳性重组克隆
• 3.5 重组表达质粒的构建
• 3.5.1 克隆质粒pGEM-fat-1、pUC-opfat-1与pEGFP-C1载体双酶切产物的纯化回收
• 3.5.2 目的片段与载体片段连接
• 3.5.3 连接产物转化
• 3.5.4 重组表达质粒筛选阳性克隆
• 3.6 重组表达质粒的菌液PCR鉴定
• 3.7 质粒DNA的小量提取
• 3.8 重组表达质粒的双酶切鉴定
• 3.9 DNA测序鉴定
• 4 实验结果
• 4.1 重组表达载体的菌液PCR筛选结果
• 4.2 重组表达载体的双酶切鉴定
• 4.3 重组表达载体的测序结果
• 5 讨论
• 5.1 绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的选择
• 5.2 构建的重组表达载体测序结果分析
• 第四章 fat-1基因在家兔胎儿成纤维细胞中的表达
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 质粒
• 1.3 主要试剂和工具酶
• 1.4 主要溶液的配制
• 1.5 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 家兔胎儿成纤维细胞的培养
• 2.1.1 原代培养
• 2.1.2 传代培养
• 2.1.3 细胞冻存与复苏
• 2.2 细胞计数
• 2.3 生长曲线绘制
• 2.4 活细胞的测定
• 2.5 G418毒性敏感实验
• 2.6 脂质体介导的外源基因转染
• 2.6.1 无内毒素质粒大量提取
• 2.6.2 脂质体介导法瞬时转染家兔胎儿成纤维细胞条件的优化
• 2.7 转染效率的测定
• 2.8 转染后阳性细胞克隆的筛选
• 2.9 转fat-1基因家兔胎儿成纤维细胞的检测
• 2.9.1 DNA水平对转基因细胞的检测
• 2.9.1.1 细胞基因组提取
• 2.9.1.2 基因组PCR检测
• 2.9.2 RNA水平对转基因细胞的检测
• 2.9.2.1 转基因细胞RNA提取
• 2.9.2.2 RT-PCR检测
• 3 实验结果
• 3.1 家兔胎儿成纤维细胞形态观察
• 3.2 家兔胎儿成纤维细胞生长曲线的绘制
• 3.3 家兔胎儿成纤维细胞的G418毒性敏感实验
• 3.4 转染细胞的的荧光检测及转染效率
• 3.5 阳性细胞克隆的获得
• 3.6 DNA水平对转基因细胞的检测
• 3.7 RNA水平对转基因细胞的检测
• 4 讨论
• 小结
• 创新点
• 参考文献
• 致谢