氧化胁迫下Alkalibacterium sp.F26的生理应答机制

论文摘要

活性氧是微生物细胞在正常代谢过程中产生的一类化学性质极其活泼的基团或分子,主要包括超氧自由基（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH）。当其产生速度超出细胞抗氧化物防御系统的清除能力时,活性氧就会攻击细胞成分引发一系列毒性效应,造成对细胞的“氧化胁迫”作用。微生物为了生存必然对这种胁迫做出应答或应激响应,通过自身的抗氧化防御系统降低活性氧的危害,从而表现为不同的生物学效应。本论文以一株高产过氧化氢酶（Catalase,简称CAT）的嗜盐嗜碱菌Alkalibacterium sp. F26为研究菌株,研究H2O2胁迫下Alkalibacterium sp.F26的生理应答机制。论文主要的研究内容与结果如下:（1）在摇瓶中采用一次性添加H2O2的方法研究H2O2瞬时刺激对CAT合成的影响。结果表明,不同时期添加H2O2对细胞生长和CAT合成的影响有较大的差异,初始添加不利于CAT的合成,但对菌体生长抑制作用不明显;对数生长后期（18 h）添加虽然对细胞生长影响较大,但细胞对H2O2的响应程度较高,表现为CAT合成水平较高,当添加浓度为3 mM时,CAT酶活达到94.56 u/mg protein。但是,当H2O2的浓度达到4 mM时,CAT酶活急剧下降,说明体内合成的CAT的量远远达不到分解外来的H2O2的需求,此浓度已严重伤害了细胞的正常代谢。（2）采用高效液相色谱技术测定胞内代谢物浓度,研究氧化胁迫对Alkalibacterium sp.F26辅因子的影响。研究结果表明:相比低浓度H2O2（<1 mmol/L）胁迫,此菌株在高浓度H2O2（>1 mmol/L）胁迫下的应答表现更为明显,即经3 mmol/L H2O2胁迫后胞内CAT酶活为106.54 u/mg protein,是对照产量的1.76倍;ATP浓度则从对照浓度20.55μmol/L下降到17.80μmol/L;NAD+浓度自对照样品的69.89μmol/L减少至31.77μmol/L。由于ATP和NAD+浓度的减少,相比未经过H2O2胁迫菌体,细胞能荷值EC从0.77降低至0.68,NADH/NAD+则从0.08增加至0.41。然而,这种应答机制在细胞受到低浓度H2O2的胁迫后并不明显:除发现100μmol/L H2O2能够导致细胞防御机制的激活而使胞内ATP浓度相比对照有所增加的情况外,经50μmol/L和500μmol/L H2O2胁迫后胞内ATP水平从对照的22.69μmol/L只下降到22.38μmol/L和13.70μmol/L;并且此种胁迫条件下NADH浓度变化也不显著。（3）考察了不同H2O2浓度对Alkalibacterium sp.F26对糖代谢关键酶的影响。结果发现,随着胁迫程度的增强,磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP）中关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）的活性逐渐升高,而对于糖酵解途径（glycolysis pathway, EMP）中的己糖激酶（hexokinase, HK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase, PK）来说,由于高浓度的氧化胁迫导致酶中巯基发生氧化修饰,两种酶的活性随胁迫程度的增大而降低。此外,细胞在受到微量H2O2胁迫后,为了保证细胞的正常代谢,三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle, TCA）中的琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性有所升高,当胁迫程度逐渐增强,生物体内的CAT来不及分解外来H2O2的时候,SDH会因活性位点铁硫中心的氧化而失活。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.1.1 活性氧的种类及其性质
• 1.1.2 环境与自由基
• 1.1.3 活性氧对生物体的氧化损伤及修复作用
• 1.1.4 微生物体内活性氧的清除
• 1.2 国内外研究进展
• 1.3 本论文的主要研究内容
• 1.3.1 目前研究存在的问题
• 1.3.2 本论文的主要研究内容
• 第二章 过氧化氢胁迫对ALKALIBACTERIUM SP.F26 过氧化氢酶合成的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 培养方法
• 2.2.4 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2CO₃ 浓度的确定'>2.3.1 种子培养基与发酵培养基中Na₂CO₃浓度的确定
• 2.3.2 Alkalibacterium sp.F26 种子生长曲线
• 2.3.3 种龄的确定
• 2.3.4 Alkalibacterium sp.F26 产CAT 的摇瓶发酵过程的考察
• 2O₂ 对CAT 合成的影响'>2.3.5 培养不同时期添加H₂O₂ 对CAT 合成的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 过氧化氢胁迫对ALKALIBACTERIUM SP.F26 辅因子的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 培养方法
• 3.2.4 分析方法
• +、NADH 的提取'>3.2.5 细胞内ATP、NAD⁺、NADH 的提取
• 3.2.6 细胞代谢物含量的测定
• 3.3 结果与讨论
• 2O₂ 胁迫下Alkalibacterium sp.F26 的应激响应'>3.3.1 高浓度H₂O₂ 胁迫下Alkalibacterium sp.F26 的应激响应
• 2O₂ 胁迫下Alkalibacterium sp.F26 的应激响应'>3.3.2 低浓度H₂O₂ 胁迫下Alkalibacterium sp.F26 的应激响应
• 3.4 本章小结
• 第四章 过氧化氢胁迫对ALKALIBACTERIUM SP.F26 糖代谢关键酶的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 培养方法
• 4.2.4 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 过氧化氢胁迫对磷酸戊糖途径关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的影响
• 4.3.2 过氧化氢胁迫对糖酵解途径关键酶己糖激酶和丙酮酸激酶活性的影响
• 4.3.3 过氧化氢胁迫对三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶活性的影响
• 4.4 本章结论
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文