一、SARS-CoV感染Vero E6细胞诱导细胞凋亡（论文文献综述）
尚超[1]（2021）在《新型冠状病毒干扰宿主细胞自噬过程及其潜在治疗靶点研究》文中提出新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是继SARS-CoV,MERS-CoV之后,β属冠状病毒造成的第三次严重的爆发流行,该病毒自2020年2月底以来迅速传播到200多个国家。2020年3月11日,世界卫生组织宣布由SARS-CoV-2感染所致2019年冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）已经迈入全球大流行阶段。同年12月,在英国和南非检测到了两株具有更高传染性的SARS-CoV-2突变株,即VOC 202012/01突变株和501Y.V2突变株。截至2021年3月10日,全球已报道超过1亿病例和260万人死亡,全球死亡比例为2.2%,且这些数字在大多数国家仍呈上升趋势。严峻的疫情形势对人类经济社会和生命安全提出挑战,我们对SARS-CoV-2的细胞内生命过程仍知之甚少,研究处于迫切需求,而基于此的抗SARS-CoV-2新靶点发现无疑会成为抗疫的一针强心剂。自噬是进化上保守的细胞过程,细胞内形成双层膜结构的自噬小体,选择性地包裹有缺陷或受损的细胞内物质,包括长寿命的蛋白质和有缺陷的细胞器,如线粒体等。晚期阶段,自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,其内容物在自噬溶酶体内被酶解和清除。细胞自噬过程激活后,降解受损的细胞器并清除病原体,具有防御和宿主保护作用。然而一部分长期存在、获得适应性的病毒包括麻疹病毒、HIV-1、基孔肯雅病毒、疱疹B病毒、柯萨奇病毒和冠状病毒等,针对性地进化出了一系列应对策略,劫持自噬元件,促进自我复制和转录。迄今为止,SARS-CoV-2与宿主细胞自噬过程之间的相互作用关系尚未得到阐明,本研究探讨了宿主细胞的防御性自噬和SARS-CoV-2侵入过程中对自噬的干扰和利用,并期望能够借此发现有效的治疗靶点。1.SARS-CoV-2抑制宿主细胞防御性线粒体自噬研究自噬具有防御和清除病原的作用,选择性线粒体自噬是自噬的特殊类型,异常线粒体被自噬小体包裹,在自噬溶酶体内被降解,为细胞代谢和新的线粒体生成提供底物。目前尚未有实验研究阐明SARS-CoV-2的基因组亚细胞定位,本部分实验采用免疫电镜和免疫荧光共定位技术标记SARS-CoV-2复制过程中的重要中间产物ds RNA,提出了线粒体与SARS-CoV-2复制之间存在密切联系。通过Tom20基因敲降技术,我们发现了线粒体外膜蛋白Tom20可能在SARS-CoV-2的线粒体定位和线粒体内复制过程中扮演了重要的角色。基于病毒在线粒体内的活动对线粒体功能的影响,我们通过JC-1染色、TMRM染色和CM-H2DCFDA探针分别检测了线粒体的膜电位、膜通道孔通透性和活性氧释放变化,结果显示SARS-CoV-2感染造成了包括线粒体膜电位去极化、膜通道孔通透性改变和活性氧应激在内的线粒体损伤病变,而通过线粒体膜稳定剂Mdivi-1和Cyclosporin A治疗线粒体损伤,对病毒的复制具有抑制作用,提示线粒体的功能异常为SARS-CoV-2复制提供了有利的条件。线粒体损伤是激活细胞内线粒体自噬清除程序的前提,通过Western Blotting和免疫荧光技术检测了线粒体自噬的经典通路,结果发现Pink1-Parkin蛋白表达量增加,且在线粒体聚积,同时我们通过敲降Pink1蛋白表达,发现由Pink1所调控的P62蛋白线粒体聚集,提示SARS-CoV-2感染激活了Pink1-Parkin通路,招募P62蛋白线粒体聚集。P62蛋白聚集的线粒体即标记成为自噬底物,异常的线粒体和病毒基因组将被自噬小体包裹,在溶酶体内降解清除。病毒干扰了这一过程,通过Western Blotting和免疫荧光技术,我们发现损伤的线粒体并未因Pink1-Parkin通路激活而得到有效清除,线粒体未成为自噬小体和溶酶体的底物。于是我们进一步采用免疫共沉淀技术,探索病毒的干预机制,结果发现SARS-CoV-2感染抑制了P62和LC3的相互结合,从而阻碍自噬小体对P62标记的线粒体进行包裹,线粒体自噬停留在了早期阶段。本部分提出线粒体与SARS-CoV-2复制之间存在密切联系,病毒感染造成宿主细胞线粒体损伤,宿主细胞通过Pink1-Parkin通路诱导线粒体自噬过程抵抗病毒感染。病毒通过抑制P62和LC3的结合,阻碍线粒体自噬以对抗宿主细胞的防御机制。2.SARS-CoV-2劫持自噬通路研究β冠状病毒MHV的NSP6蛋白可以激活Atg5依赖性自噬。表达SARS-CoV和MERS-CoV的NSP3 PLpro蛋白激活了自噬小体的形成通路,抑制自噬小体与溶酶体的融合过程,导致自噬小体蓄积。相似的,MERS-CoV病毒感染抑制Vero B4细胞自噬溶酶体形成。目前,仍未有正式发表的文章报道SARS-CoV-2诱导的上述细胞自噬过程和通路变化。本部分采用Western Blotting、免疫组化和透射电镜技术在SARS-CoV-2感染的非人灵长类动物肺组织、Vero E6细胞和Huh-7细胞中确认了病毒诱导的自噬小体数量增加。通过m Cherry-EGFP-LC3标记、自噬小体和溶酶体共标记、以及自噬底物的清除效率检测,确认了SARS-CoV-2诱导的自噬小体数量增加来源于（1）自噬小体生物合成增加,（2）自噬小体-溶酶体融合受阻,即自噬小体清除障碍。最后,本部分在Vero E6细胞上对介导自噬小体形成的级联通路进行了Western Blotting检测,结果显示SARS-CoV-2通过抑制Akt-mTOR通路,激活VPS34复合物并促进Atg5-Atg12、Atg16蛋白表达增加,上述通路变化与自噬小体生成增加相符合。本部分阐明了SARS-CoV-2侵入细胞后胞内自噬过程的变化,表现为自噬小体-溶酶体融合过程受阻,伴Akt-mTOR通路和VPS34复合物介导的自噬小体形成增加,导致自噬小体蓄积。3.自噬小体诱导蛋白VPS34作为潜在抗SARS-CoV-2靶点研究调节自噬被认为有希望成为潜在抗SARS-CoV-2策略之一。目前,自噬通路上尚未有明确的药物靶点,药物设计无从入手。前一章节中我们观察到了SARS-CoV-2感染宿主细胞后诱导的一系列宿主细胞自噬过程的改变,为明确自噬变化对病毒本身的意义,本部分针对自噬小体的形成通路,通过药物干预或siRNA干扰或基因敲除手段调节自噬相关蛋白的活性,检测Vero E6细胞内SARS-CoV-2的复制水平,结果发现VPS34蛋白抑制剂SAR405和3-MA,以及VPS34复合物关键亚基之一Atg14敲降,对SARS-CoV-2复制具有显着抑制作用,而Atg5基因敲除对病毒复制无明显影响。综上,我们筛选出候选的抗病毒靶点VPS34蛋白,并评价了VPS34抑制剂的体内抗SARS-CoV-2作用。在人血管紧张素转化酶II（Human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2）转基因小鼠模型上的结果表明,VPS34活性抑制剂3-MA显着抑制了SARS-CoV-2在hACE2转基因小鼠肺组织中的复制,并改善了肺炎损伤。相对的,mTOR抑制剂Rapamycin则加重了SARS-CoV-2感染。最后,我们进一步在人肺组织上评价了3-MA的抗病毒有效性,研究中首次报道了人肺移植小鼠可以作为SARS-CoV-2的感染模型,评价结果显示VPS34活性抑制剂3-MA显着抑制了SARS-CoV-2在人肺组织中的N基因和E基因拷贝,减少了可感染病毒颗粒数,且对SARS-CoV-2相关肺炎病变具有治疗作用。本部分提出抑制自噬诱导蛋白VPS34活性具有抗SARS-CoV-2作用,为药物设计提供了一条可行思路。4.自噬小体-溶酶体融合抑制剂体内外抗SARS-CoV-2作用评价自噬小体-溶酶体融合抑制剂抑制了自噬进程的终末阶段,前面章节中我们发现,SARS-CoV-2作用类似自噬溶酶体抑制剂。典型的自噬小体-溶酶体融合抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）在COVID-19流行早期就被用作治疗性药物之一,其机制可能为过度的自噬小体蓄积导致受感染细胞死亡,终止病毒的复制周期。目前,鲜少有研究报道除CQ外其他自噬小体-溶酶体融合抑制剂的抗SARS-CoV-2作用。本部分内容首先在细胞水平上评价了自噬小体-溶酶体融合抑制剂CQ、Bafilomycin A1和NH4CL的体外抗SARS-CoV-2作用,结果显示CQ、Bafilomycin A1和NH4CL抑制了SARS-CoV-2在Vero E6、Huh-7、293T-hACE2细胞中的复制。CQ和Bafilomycin A1提高了SARS-CoV-2感染后Vero E6细胞的存活率。体内实验结果表明,CQ和Bafilomycin A1抑制了SARS-CoV-2在hACE2转基因小鼠肺组织中的复制,改善了肺炎损伤。本部分内容提出了除CQ外,自噬小体-溶酶体融合抑制剂Bafilomycin A1作为潜在抗SARS-CoV-2候选药物的可行性。
王翼[2]（2021）在《靶向新型冠状病毒包膜蛋白的小分子抑制剂发现》文中研究指明包膜蛋白（envelope protein,E）是冠状病毒中最小的结构蛋白。不同冠状病毒来源的包膜蛋白功能相似,部分已被证实能够作为离子通道参与病毒的出芽与复制。敲除包膜蛋白的编码基因或使用靶向包膜蛋白的小分子抑制剂能够抑制冠状病毒的复制。新型冠状病毒包膜蛋白（SARS-CoV-2 envelope protein,2-E）与其他冠状病毒的包膜蛋白具有极高的同源性,已有研究证明其跨膜区能形成五聚体孔状结构,敲除2-E的编码基因能够抑制新冠病毒的复制。然而,2-E的功能属性尚不清晰,探究2-E在体内外的生理病理功能具有重要意义。首先,本研究采用平面脂双层工作站证实了2-E能够形成p H敏感的阳离子通道;进一步实验揭示2-E不仅能诱导多种细胞死亡,同时可诱导体内、体外的炎症反应。通过将2-E蛋白氨基酸残基逐一单点突变为丙氨酸的策略,我们获得了削弱2-E通道活性的显性负突变,且该突变还可降低2-E介导的细胞死亡,减少SARS-CoV-2的复制。以上结果提示2-E通过形成阳离子通道,在体内损伤和病毒复制中发挥重要作用。随后,我们在与药物化学家的合作中发现天然产物BE-12（小檗胺）有着良好的2-E通道抑制活性。体外抗病毒实验显示该通道抑制剂能够抑制SARS-CoV-2在细胞中的复制。基于此结果,我们将BE-12进行一系列的结构改造,发现BE-30、BE-31、BE-32、BE-33等新型小分子表现出更强的2-E通道抑制活性,同时具有更好的细胞保护作用和抗病毒活性。值得注意的是,这些通道抑制剂在电生理活性、细胞保护活性以及抗病毒活性中具有良好的相关性,提示这些小分子可能通过抑制2-E通道功能发挥抗病毒作用。我们选择该系列化合物中体外抗病毒活性最强的BE-33进行了体内抗病毒活性检测,结果发现BE-33不仅能够降低体内的病毒滴度,同时可以缓解肺组织损伤并降低炎症的发生。由此,我们推测2-E通道是一个潜在的抗SARS-CoV-2药物靶点。最后,我们利用2-E通道介导细胞死亡的特性,在细胞水平构建了靶向2-E通道的高通量筛选方法。我们首先对4376个化合物进行高通量筛选,进一步在2-E通道水平、体外抗病毒水平进行复筛,最终发现渥曼青霉素、原花青素以及维利帕尼有着良好的通道抑制、细胞保护以及抗病毒活性。由此,我们证明了该筛选体系可用于发现靶向2-E的抗病毒小分子。综上所述,本研究证实了2-E通道是一个极具潜力的抗SARS-CoV-2药物靶点,提供了一系列有着显着抗病毒活性的2-E小分子抑制剂,并为新冠肺炎的治疗提供了新的策略。
张记宇[3]（2021）在《猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导宿主细胞凋亡的分子机制》文中指出猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-Co V）是2017年首次在中国发现的猪肠道冠状病毒,主要引起5日龄以下的新生仔猪水样腹泻、呕吐、脱水、最终死亡。SADS-Co V的暴发引起了研究人员的高度重视,然而SADS-Co V感染是否诱导宿主细胞凋亡以及诱导的细胞凋亡对SADS-Co V复制的影响尚不清楚。因此本研究的目的与意义就是探究SADS-Co V感染诱导宿主细胞凋亡的现象以及细胞凋亡对SADS-Co V复制的影响,解析SADS-Co V感染引起细胞凋亡的发生途径,详细阐明SADS-Co V感染与细胞凋亡之间的相互作用机制,为SADS-Co V的防控提供科学依据与理论基础。为了揭示SADS-Co V在体内和体外是否能诱导细胞凋亡。通过透射电镜观察感染SADS-Co V的Vero E6细胞,结果发现细胞明显皱缩,线粒体肿胀,细胞核萎缩,染色质凝聚。TUNEL方法检测发现SADS-Co V感染Vero E6和IPI-2I细胞后诱导明显的细胞凋亡。DNA Ladder分析结果显示,SADS-Co V感染可使细胞基因组的DNA发生断裂出现明显的片段化,且DNA片段化程度随着接毒时间的延长和接毒剂量的增加而增加。为了进一步得到准确的细胞凋亡比率,本研究采用流式细胞术检测细胞,结果显示细胞凋亡比率随着SADS-Co V感染时间的延长而增高,SADS-Co V感染后48 h凋亡率分别为25.7%（Vero E6）和37.5%（IPI-2I）,表明SADS-Co V感染Vero E6和IPI-2I细胞后诱导明显的细胞凋亡。Caspase是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,是细胞凋亡发生过程中的关键酶。Western blot结果显示SADS-Co V感染Vero E6和IPI-2I细胞能激活Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3,活化的Caspase-3剪切下游PARP（poly ADP-ribose polymerase）,使PARP失活而诱导凋亡。同时SADS-Co V感染的仔猪回肠组织中Caspase-3和PARP均被切割,表明SADS-Co V在体内诱导仔猪回肠上皮细胞凋亡。为了进一步确定SADS-Co V诱导细胞凋亡的途径,Western blot结果显示SADS-Co V感染Vero E6细胞后,Fas L上调表达,表明SADS-Co V能激活Fas L介导的外源性途径。此外,SADSCo V感染可导致Bid被切割成15 k Da t Bid,表明Fas L介导的凋亡信号激活Caspase-8,进而切割Bid。切割的Bid促进Caspase-9的激活,将内源性和外源性途径相互联系。本研究也通过Western blot、流式细胞术、免疫荧光等试验方法检测使用不同的凋亡抑制剂后细胞的凋亡情况和病毒的复制情况。结果显示,使用广谱凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK（Caspases-8的抑制剂）和Z-LEHD-FMK（Caspases-9的抑制剂）均能抑制PARP的裂解和SADS-Co V N蛋白的表达,且病毒滴度也呈剂量依赖性降低。激光共聚焦试验和Western blot检测结果显示SADS-Co V感染后促凋亡蛋白Bax和细胞色素c（Cyt c）分别重新定位于线粒体和细胞质,表明SADS-Co V通过线粒体介导的内源性途径诱导凋亡。亲环素D（Cyp D）位于线粒体膜基质中,是线粒体通透性转换孔（MPTP）开放过程中的主要成分。使用Cyp D的特异性抑制剂环孢素A（Cs A）孵育Vero E6和IPI-2I细胞可抑制SADS-Co V诱导的凋亡和病毒复制,表明Cyp D参与了这个过程。综合以上研究表明,Fas/Fas L介导的死亡受体途径和线粒体介导的内源性凋亡途径在SADSCo V感染的细胞中都被激活,揭示了SADS-Co V诱导细胞凋亡的分子机制,提高了我们对SADSCo V发病机制的认识。
梁荣,宋海鑫,黄佳玲,费荣梅,张金秋[4]（2021）在《PEDV流行毒株JS2013诱导Vero细胞凋亡》文中研究表明[目的]本试验旨在研究猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）流行毒株JS2013诱导Vero细胞凋亡的相关机制。[方法]用添加5μg·mL-1胰酶的Vero细胞成功扩增PEDV JS2013毒株后,采用倒置显微镜、间接免疫荧光、流式细胞术、Hoechst染色、细胞活性计数（CCK-8）以及Western blot等方法,检测Vero细胞感染JS2013后产生的病变、凋亡细胞比例、细胞活性、凋亡相关蛋白的表达等。[结果]PEDV JS2013感染Vero细胞后6 h即有少量病毒进入细胞,24 h后出现典型合胞体病变,PEDV JS2013诱导Vero细胞凋亡呈剂量依赖性,并且显着抑制Vero细胞活性。Hoechst染色后可以观察到明显的凋亡小体。Western blot结果表明,感染PEDV JS2013 48 h后激活Caspase 8和Caspase 9,60 h左右激活Caspase 3。[结论]PEDV流行毒株JS2013可以诱导Vero细胞凋亡。
石达[5]（2020）在《猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬的机制研究》文中提出冠状病毒（Coronavirus,CoVs）这一大类病毒广泛存在于自然界中,常见禽类、哺乳动物以及人类都易感。自2003年SARS-CoV（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV）的流行到2012年的MERS-CoV（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV）的出现,再到2020年最大的“黑天鹅事件”-新型冠状病毒疫情的暴发,均引起了全世界人类的恐慌。2010-2013年猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）以及2017年新发现的猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV）,更是重创了世界畜牧业,至此,人们才对冠状病毒感染后致病的严重程度以及快速的传播能力给予了足够的重视。SADS-CoV作为一种新发现的冠状病毒,属于冠状病毒科Alpha冠状病毒属,是有囊膜包被的单股正链RNA病毒。自2017年首次在中国猪场发现和报道以来,已经在广东清远地区猪场引发了严重的仔猪腹泻疫情。病毒作为一种专性细胞内寄生物,其在感染过程中必定会与宿主的胞内应答发生相互作用。细胞自噬（Autophagy）作为一种保守的胞内适应性应答,在维持细胞稳态,促进新陈代谢方面起着举足轻重的作用。它可将细胞内的衰老细胞器、外源微生物等成分包裹在一个称为自噬体的双层膜结构中,运送至溶酶体进行降解回收。自噬是机体对抗病原体的天然防御机制,但最近越来越多的证据表明许多病毒已进化出多种策略抵抗、逃逸、甚至利用细胞自噬促进自身增殖,如流感病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、轮状病毒等。对于SADS-CoV而言,其复制感染与细胞自噬之间的相互作用及其启动机制便是本研究中要探索的问题。首先,采用三种经典方法对SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞后是否诱导自噬进行了检测,包括透射电镜观察自噬体的形成,激光共聚焦检测荧光聚点的变化以及Western blot分析LC3的转化。结果表明,与对照相比,SADS-CoV感染后诱导Vero E6细胞产生自噬体样双层膜结构,GFP-LC3荧光聚点显着累积,而且LC3发生了明显的类别转换,同时证明SADS-CoV诱导的自噬严格依赖于病毒的复制,由此证实SADS-CoV感染可以诱导细胞自噬的发生。其次,进一步研究了细胞自噬对病毒复制的影响。结果显示利用自噬诱导剂Rapamycin处理细胞诱导自噬反应后,上调了病毒的复制;利用自噬阻断剂3-MA处理细胞降低自噬反应后,下调了病毒的复制。敲低自噬关键性基因ATG5和LC3抑制自噬后,病毒N蛋白表达显着的减少,同时上清中子代病毒的含量也显着的降低。上述结果证明了SADS-CoV的有效复制是诱导自噬的关键因素,并可以利用自噬促进自身增殖。再次,对SADS-CoV是否诱导完整自噬潮进行了分析。自噬潮,即自噬的整个动态连续的过程,可通过p62的降解、LC3-Ⅱ的周转、自噬小体和溶酶体共定位分析等综合评价。研究结果显示,SADS-CoV感染促进了自噬底物p62的降解;3D活细胞激光共聚分析发现SADS-CoV感染促进了自噬小体和溶酶体的融合;同时SADS-CoV感染后GFP-LC3标记的自噬小体和LysoTracker标记的溶酶体出现了明显的共定位;最后配合使用溶酶体抑制剂CQ,发现LC3-Ⅱ和p62出现了明显的蓄积,以上结果表明SADS-CoV感染诱导了自噬的起始和自噬性降解过程,即SADS-CoV感染可诱导完整的自噬潮。最后,为了深入探索SADS-CoV感染激活自噬的机制,本研究对内质网应激与自噬之间关系进行了系统分析。结果显示SADS-CoV感染在体内和体外均能诱导内质网应激,同时可激活PERK-EIF2S1、ATF6和IRE1三条信号通路,进一步利用特异性抑制剂或激活剂,RNA干扰和关键蛋白过表达发现仅IRE1信号通路在SADS-CoV诱导细胞自噬过程中起到关键性作用。综上所述,本研究阐明了（1）SADS-CoV感染诱导Vero E6和ST细胞自噬;（2）自噬过程有利于SADS-CoV的复制;（3）SADS-CoV可通过UPR的IRE1信号途径激活自噬。研究结果推动了SADS-CoV与宿主相互作用领域的研究,为探索SADS-CoV发病机制提供了全新的视角,为抗病毒药物的筛选奠定了基础。
汤筱艳[6]（2020）在《SARS-CoV刺突蛋白嵌合型重组VSV的构建与免疫原性研究》文中提出重症急性呼吸综合征（Severe acute respiratory syndrome,SARS）是由重症急性呼吸综合征病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）引起的一种急性,发热,并伴有呼吸道感染等严重并发症的致死性传染病。该病传播速度快、死亡率高,且尚无有效的抗病毒药物和商业化疫苗。虽然从2004年以来没有新的SARS感染病例报道,但是该病仍然有再次流行的可能,进而严重威胁民众的健康。2019年12月我国湖北省武汉市爆发了由SARS-CoV-2引起的COVID-19疫情,研究表明该病毒是一种类SARS样新型冠状病毒,说明SARS-CoV依然存在突破物种屏障并通过中间宿主传染给人类的潜在危险,因此研发SARS-CoV储备型疫苗对我国防控SARS具有十分重要的意义。SARS-CoV是冠状病毒科（Coronaviridae）、β-冠状病毒属（β-Coronavirus）成员。刺突蛋白（Spike protein,S）是SARS-CoV的跨膜糖蛋白,主要负责与细胞受体结合、诱导病毒与细胞融合以及刺激机体产生免疫应答等,是SARS-CoV最重要的免疫原性蛋白。水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）是弹状病毒科（Rhabdoviridae）、水泡病毒属（Vesiculovirus）成员。VSV作为重组病毒疫苗载体具有很多优点:VSV是一种RNA病毒,其基因组不会整合到宿主细胞中;VSV增殖速度快、滴度高,单次免疫就能产生有效保护;插入的外源基因稳定并且表达效率高;VSV对普通人群的致病性极低,具有较高的安全性。本研究以实验室成功构建的嵌合型VSV反向遗传操作系统为基础,将VSV的嚢膜糖蛋白（Glycoprotein,GP）替换为SARS-CoV S蛋白,成功拯救出重组病毒并分别命名为VSVΔG-SARS和VSVΔG-eGFP-SARS。Western blot和激光共聚焦实验证明重组病毒可以正确表达SARS-CoV S蛋白,间接免疫荧光实验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）结果显示重组病毒依赖宿主细胞的细胞受体血管紧张素转换酶2（Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）完成入侵,进一步表明SARS-CoV S蛋白在重组病毒中成功表达。通过电镜发现重组病毒呈现弹状病毒的典型形态,同时S蛋白嵌合在重组病毒嚢膜表面。病毒的生长动力曲线结果表明重组病毒的滴度低于亲本毒wtVSV,但仍然可以满足免疫滴度的需要。在小鼠的安全评价实验中小鼠未表现出任何临床症状,初步说明重组病毒对小鼠具有良好的安全性。在免疫效力评价中,首先通过中和试验和ELISA实验证明重组病毒能刺激小鼠产生较高水平的体液免疫,进一步通过ELISPOT实验证明重组病毒也可以诱导恒河猴较强的细胞免疫应答,表明重组病毒具有良好的免疫原性。本研究利用VSV嵌合型反向遗传系统,成功制备了嵌合型重组病毒VSVΔG-SARS和VSVΔG-eGFP-SARS,并利用小鼠和恒河猴对VSVΔG-SARS的免疫原性进行评估,证明该重组病毒具有作为SARS-CoV储备型疫苗的潜在价值,同时也为研发以VSV为载体SARS-CoV-2的疫苗提供了可行性。
Gu Yanni,Shen Chaobin,Chen Tongxin[7]（2020）在《Advance in human coronaviruses research of host interactions》文中认为2019-novel coronavirus （2019-nCoV） is a highly pathogenic human CoV that first emerged in Wuhan in 2019.2019-nCoV has a zoonotic origin and poses a major threat to public health.However, little is known about the viral factors contributing to the high virulence of 2019-nCoV.Many animal viruses, including CoVs, encode proteins that interfere with host gene expression, including those involved in antiviral immune responses, and these viral proteins are often major virulence factors.Human coronaviruses （HCoVs） are known respiratory pathogens associated with a range of respiratory infection.In the past 17 years, the onset of 2019-nCoV, severe acute respiratory syndrome coronavirus （SARS-CoV） and Middle East respiratory syndrome coronavirus （MERS-CoV） have thrust HCoVs into spotlight of the research community due to their high pathogenicity in humans.The recent study of HCoVs-host interactions has contributed extensively to our understanding of infection pathogenesis of 2019-nCoV.This review discuss various host physiopathologic mechanism, such as apoptosis, innate immunity, endoplasmic reticulum （ER） stress response, mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway and nuclear factor kappa B （NF-κB） pathway that may be modulated by HCoVs and provides evidence for the intensive investigate of 2019-nCoV infection.
顾燕妮,沈朝斌,陈同辛[8]（2020）在《人类冠状病毒感染与宿主的相互作用》文中研究指明在武汉首次出现的2019新型冠状病毒（2019-novel coronavirus,2019-nCoV ）是一种高致病性人类冠状病毒（human coronaviruses,HCoVs）。HCoV感染属人畜共患病,对公共卫生构成重大威胁。然而,对导致这次2019-nCoV的高侵袭力了解甚少。许多动物源性病毒编码的蛋白干扰了宿主抗病毒免疫应答,这些病毒蛋白通常是主要的毒力因子。人类冠状病毒是与呼吸道感染相关的病原体。在过去的17年中,2019-nCoV、严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）感染人类的事件相继暴发,使HCoV成为研究领域的热点。HCoV与宿主相互作用的研究有助于理解本次2019-nCoV感染的发病机制。本综述涉及近年来HCoV感染对宿主细胞凋亡、固有免疫应答、内质网应激应答、丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和核因子kappa B （nuclear factor kappa B,NF-κB）信号通路等多层次影响的研究进展,为今后深入研究2019-nCoV感染发病机制提供参考。
顾燕妮,沈朝斌,陈同辛[9]（2020）在《人类冠状病毒感染与宿主的相互作用》文中进行了进一步梳理在武汉首次出现的2019新型冠状病毒（2019-novel coronavirus, 2019-nCoV ）是一种高致病性人类冠状病毒（human coronaviruses, HCoVs）。HCoV感染属人畜共患病, 对公共卫生构成重大威胁。然而, 对导致这次新冠肺炎病毒的高侵袭力了解甚少。许多动物源性病毒编码的蛋白干扰了宿主抗病毒免疫应答, 这些病毒蛋白通常是主要的毒力因子。人类冠状病毒是与呼吸道感染相关的病原体。在过去的17年中, 2019-nCoV、严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）感染人类的事件相继暴发, 使HCoV成为研究领域的热点。HCoV与宿主相互作用的研究有助于理解本次2019-nCoV感染的发病机制。本综述涉及近年来HCoV感染对宿主细胞凋亡、固有免疫应答、内质网应激应答、丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和核因子kappa B （nuclear factor kappa B, NF-κB）信号通路等多层次影响的研究进展, 为今后深入研究2019-nCoV感染发病机制提供参考。
谢春芳,于瑞嵩,董世娟,司伏生,陈冰清,王剑,马进雯,李震[10]（2020）在《冠状病毒感染调控细胞凋亡机制研究进展》文中进行了进一步梳理冠状病毒是常见的感染人类和动物并造成健康危害的主要病原性微生物之一,冠状病毒感染细胞后,细胞产生免疫应答,病毒为了在细胞内转录翻译和装配下一代,应对细胞免疫应答的同时,还参与到许多细胞活动中,当细胞特定受体与病毒蛋白结合后,细胞即启动凋亡程序。冠状病毒的许多蛋白在细胞凋亡程序中起促进或抑制凋亡的不同作用,如病毒S蛋白与细胞膜死亡受体作用诱导细胞启动外在凋亡途径,病毒感染细胞后产生的M、S蛋白引起细胞内质网应激、Ca2+失衡,诱导细胞启动内在凋亡途径,而E蛋白则抑制细胞凋亡的发生。本文综述了冠状病毒对侵染细胞的促凋亡或抑制凋亡作用及其作用机制,通过了解病毒不同蛋白在各种凋亡途径中的不同作用,希望为人工干预调控细胞研究提供思路,为冠状病毒感染防控提供理论支持。
二、SARS-CoV感染Vero E6细胞诱导细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SARS-CoV感染Vero E6细胞诱导细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）新型冠状病毒干扰宿主细胞自噬过程及其潜在治疗靶点研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 SARS-CoV-2 抑制宿主细胞防御性线粒体自噬研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 抗体 |
| 1.1.4 质粒和小干扰RNA(siRNA) |
| 1.1.5 主要试剂 |
| 1.1.6 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 SARS-CoV-2 细胞感染试验 |
| 1.2.2 RNA转染试验 |
| 1.2.3 质粒转染试验 |
| 1.2.4 免疫荧光试验 |
| 1.2.5 免疫电镜试验 |
| 1.2.6 细胞总蛋白提取 |
| 1.2.7 BCA蛋白浓度检测 |
| 1.2.8 蛋白免疫印迹(Western Blotting)试验 |
| 1.2.9 病毒N基因拷贝数检测试验 |
| 1.2.10 线粒体膜电位检测试验 |
| 1.2.11 线粒体膜通道孔通透性检测试验 |
| 1.2.12 活性氧检测试验-H2DCFDA探针法 |
| 1.2.13 线粒体自噬染色试验 |
| 1.2.14 免疫共沉淀试验 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 宿主细胞线粒体内存在SARS-CoV-2 基因组复制过程 |
| 1.3.2 SARS-CoV-2 基因组复制过程不位于内质网和溶酶体内 |
| 1.3.3 SARS-CoV-2 感染导致线粒体膜电位下降和活性氧释放增加 |
| 1.3.4 线粒体膜稳定剂抑制 SARS-CoV-2 复制 |
| 1.3.5 SARS-CoV-2 RNA在 Tom20 的辅助下进入线粒体 |
| 1.3.6 SARS-CoV-2 感染上调Pink1和Parkin蛋白含量 |
| 1.3.7 SARS-CoV-2 感染激活Pink1-Parkin通路招募P62 蛋白线粒体聚集 |
| 1.3.8 SARS-CoV-2 阻碍P62和LC3 结合抑制线粒体自噬 |
| 1.3.9 SARS-CoV-2 复制干扰宿主细胞线粒体自噬过程 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 SARS-CoV-2 劫持自噬通路研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 动物 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 质粒 |
| 2.1.6 主要试剂 |
| 2.1.7 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SARS-CoV-2 细胞感染试验 |
| 2.2.2 药物处理 |
| 2.2.3 质粒转染试验 |
| 2.2.4 免疫荧光试验 |
| 2.2.5 透射电镜试验 |
| 2.2.6 SARS-CoV-2 食蟹猴感染试验 |
| 2.2.7 苏木精和伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色试验 |
| 2.2.8 免疫组化试验 |
| 2.2.9 细胞和组织蛋白提取 |
| 2.2.10 BCA蛋白浓度检测 |
| 2.2.11 蛋白免疫印迹(Western Blotting)试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SARS-CoV-2 感染诱导食蟹猴肺组织损伤及自噬小体增加 |
| 2.3.2 SARS-CoV-2 增加Vero E6和Huh-7 细胞中自噬小体聚积 |
| 2.3.3 SARS-CoV-2 抑制自噬底物降解 |
| 2.3.4 SARS-CoV-2 抑制Vero E6 细胞自噬小体和溶酶体融合 |
| 2.3.5 SARS-CoV-2 通过Akt-mTOR通路激活自噬小体形成的级联通路 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 自噬小体诱导蛋白VPS34 作为潜在抗SARS-CoV-2 靶点研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 动物 |
| 3.1.4 抗体 |
| 3.1.5 药物和siRNA |
| 3.1.6 主要试剂 |
| 3.1.7 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞攻毒 |
| 3.2.2 RNA转染试验 |
| 3.2.3 细胞蛋白提取 |
| 3.2.4 BCA蛋白浓度检测 |
| 3.2.5 蛋白免疫印迹(Western Blotting)试验 |
| 3.2.6 动物实验 |
| 3.2.7 H&E染色试验 |
| 3.2.8 免疫组化试验 |
| 3.2.9 原位杂交试验 |
| 3.2.10 病毒N和E基因拷贝数检测 |
| 3.2.11 病毒滴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 VPS34 抑制剂抑制 SARS-CoV-2在Vero E6 细胞中的复制 |
| 3.3.2 VPS34 抑制剂改善SARS-CoV-2 感染hACE2 转基因小鼠肺炎损伤 |
| 3.3.3 VPS34 抑制剂抑制 hACE2 转基因小鼠肺组织中SARS-CoV-2 复制 |
| 3.3.4 VPS34 抑制剂抑制人肺组织中SARS-CoV-2 复制并改善肺炎损伤 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 自噬小体-溶酶体融合抑制剂体内外抗SARS-CoV-2 作用评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 细胞 |
| 4.1.3 动物 |
| 4.1.4 药物 |
| 4.1.5 主要试剂 |
| 4.1.6 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 SARS-CoV-2 细胞感染和给药 |
| 4.2.2 CCK-8 细胞活性检测 |
| 4.2.3 结晶紫染色试验 |
| 4.2.4 hACE2 转基因小鼠感染给药试验 |
| 4.2.5 原位杂交试验 |
| 4.2.6 H&E染色试验 |
| 4.2.7 病毒N基因拷贝数检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 自噬小体-溶酶体抑制剂增加SARS-CoV-2 感染Vero E6 细胞存活率 |
| 4.3.2 自噬小体-溶酶体抑制剂抑制体外SARS-CoV-2 复制 |
| 4.3.3 自噬小体-溶酶体抑制剂抑制 hACE2 转基因小鼠肺部SARS-CoV-2 复制 |
| 4.3.4 自噬小体-溶酶体抑制剂改善SARS-CoV-2 感染hACE2 转基因小鼠肺炎损伤 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（2）靶向新型冠状病毒包膜蛋白的小分子抑制剂发现（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 病毒孔蛋白 |
| 1.2 新型冠状病毒 |
| 1.2.1 新型冠状病毒的简介 |
| 1.2.2 新型冠状病毒与宿主病理变化 |
| 1.2.3 新型冠状病毒与宿主炎症反应 |
| 1.2.4 新型冠状病毒的疫苗和药物研发现状 |
| 1.3 冠状病毒包膜蛋白 |
| 1.3.1 包膜蛋白的结构 |
| 1.3.2 包膜蛋白的定位 |
| 1.3.3 包膜蛋白形成离子通道 |
| 1.3.4 包膜蛋白参与病毒的组装与释放 |
| 1.3.5 包膜蛋白参与病毒的发病机制 |
| 1.4 立题依据 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂和缓冲液配制 |
| 2.1.2 质粒和细胞 |
| 2.1.3 电生理溶液 |
| 2.1.4 主要的仪器设备 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 点突变及同源重组 |
| 2.2.2 质粒抽取 |
| 2.2.3 细胞培养及转染 |
| 2.2.4 细胞存活率检测 |
| 2.2.5 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR(RT-q PCR) |
| 2.2.7 SARS-CoV-2-E 的纯化 |
| 2.2.8 平面脂双层工作站(The planar lipid bilayer workstation,BLM) |
| 2.2.9 高通量筛选 |
| 2.2.10 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.2.11 体外抗病毒实验 |
| 2.2.12 体内抗病毒实验 |
| 2.2.13 数据处理和统计 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 2-E蛋白形成阳离子通道 |
| 3.1.1 2-E蛋白介导典型的单通道电流 |
| 3.1.2 2-E蛋白能够通透二价阳离子 |
| 3.1.3 2-E蛋白能够通透氢离子 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 2-E蛋白的生理病理功能 |
| 3.2.1 2-E蛋白介导细胞死亡 |
| 3.2.2 2-E蛋白介导体外炎症 |
| 3.2.3 2-E蛋白介导体内炎症 |
| 3.2.4 2-E蛋白显性负突变可减弱病毒复制 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 2-E蛋白抑制剂具有抗病毒作用 |
| 3.3.1 经典通道抑制剂的检测 |
| 3.3.2 BE-12 及其衍生物的通道抑制作用 |
| 3.3.3 BE-12 及其衍生物的抗病毒作用 |
| 3.3.4 BE-33 的体内抗病毒作用 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 2-E蛋白抑制剂的高通量筛选 |
| 3.4.1 基于细胞保护活性的高通量筛选 |
| 3.4.2 通道抑制及抗病毒活性检测 |
| 3.4.3 小结 |
| 第四章 研究总结和展望 |
| 4.1 研究总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导宿主细胞凋亡的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 冠状病毒概述 |
| 1.1.1 冠状病毒的分类 |
| 1.1.2 冠状病毒基因组结构 |
| 1.1.3 猪冠状病毒 |
| 1.2 猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展 |
| 1.2.1 SADS-CoV的分类地位 |
| 1.2.2 SADS-CoV的流行病学及传播途径 |
| 1.2.3 SADS-CoV的病毒粒子及基因组结构 |
| 1.2.4 SADS-CoV的细胞培养及传代 |
| 1.2.5 SADS-CoV的临床症状及病理变化 |
| 1.2.6 SADS-CoV的诊断方法 |
| 1.3 细胞凋亡 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 细胞凋亡的过程 |
| 1.3.3 细胞凋亡与细胞坏死的区别 |
| 1.3.4 细胞凋亡的生理意义 |
| 1.3.5 细胞凋亡的发生途径 |
| 1.4 病毒感染与细胞凋亡 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 猪急性腹泻综合征冠状病毒感染诱导细胞凋亡 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 病毒、细胞和抗体 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 超微结构观察 |
| 2.2.2 SADS-CoV感染Vero E6细胞的病变观察 |
| 2.2.3 DNA Ladder检测 |
| 2.2.4 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 Western blot检测相关蛋白 |
| 2.2.7 间接免疫荧光 |
| 2.2.8 药物配制及细胞处理 |
| 2.2.9 激光共聚焦观察 |
| 2.2.10 细胞线粒体分离 |
| 2.2.11 CCK-8试验检测药物对细胞活性的影响 |
| 2.2.12 SADS-CoV TCID_(50)测定 |
| 2.2.13 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SADS-CoV感染诱导Vero E6和IPI-2I细胞凋亡 |
| 2.3.2 SADS-CoV感染激活Caspase相关蛋白并裂解PARP |
| 2.3.3 抑制SADS-CoV诱导的凋亡后病毒复制减弱 |
| 2.3.4 SADS-CoV感染同时激活内源性和外源性凋亡途径 |
| 2.3.5 SADS-CoV感染诱导凋亡是经过Fas/FasL依赖性途径 |
| 2.3.6 SADS-CoV感染促进Bax和Cyt c转位 |
| 2.3.7 SADS-CoV感染Vero E6细胞后AIF不发生重新定位 |
| 2.3.8 CsA抑制SADS-CoV诱导的细胞凋亡并减弱病毒复制 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）PEDV流行毒株JS2013诱导Vero细胞凋亡（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 PEDV扩增胰酶浓度的筛选 |
| 1.2.2 PEDV的增殖 |
| 1.2.3 间接免疫荧光(IFA)观察PEDV感染 |
| 1.2.4 流式细胞术检测PEDV诱导细胞凋亡 |
| 1.2.5 Hoechst染色检测细胞凋亡 |
| 1.2.6 PEDV JS2013对细胞活性检测的影响 |
| 1.2.7 Western blot 检测蛋白质表达 |
| 1.3 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 适宜PEDV JS2013扩增的胰酶浓度 |
| 2.2 PEDV JS2013感染Vero细胞后的病变观察 |
| 2.3 间接免疫荧光(IFA)确定PEDV JS2013感染情况 |
| 2.4 Hoechst染色检测凋亡小体的形成 |
| 2.5 流式细胞术检测PEDV JS2013对细胞凋亡的影响 |
| 2.6 PEDV JS2013感染对细胞活性的影响 |
| 2.7 PEDV JS2013感染对Caspase通路的影响 |
| 3 讨论 |
（5）猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 冠状病毒概述 |
| 1.2 猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展 |
| 1.2.1 SADS-CoV致病的临历床症状 |
| 1.2.2 宏基因组学分析 |
| 1.2.3 SADS-CoV的分子特征 |
| 1.2.4 SADS-CoV感染宿主细胞受体研究 |
| 1.2.5 SADS-CoV动物回归试验 |
| 1.2.6 SADS-CoV诊断方法的研究 |
| 1.3 自噬的研究进展 |
| 1.3.1 自噬的生物学功能和分子机制 |
| 1.3.2 自噬的检测方法 |
| 1.4 自噬的信号调节 |
| 1.5 病毒感染与自噬的相互关系 |
| 1.5.1 自噬的抗病毒作用 |
| 1.5.2 自噬对病毒复制的促进 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 SADS-CoV感染通过UPRIRE1通路诱导自噬并促进病毒的复制 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 相关溶液配制 |
| 2.2.2 真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 利用透射电镜观察自噬体 |
| 2.2.4 pAcGFP-LC3B转染细胞检测病毒对LC3的影响 |
| 2.2.5 Western blot对病毒蛋白及自噬相关基因的检测 |
| 2.2.6 激光共聚焦观察 |
| 2.2.7 3D活细胞成像 |
| 2.2.8 药物配制及细胞处理 |
| 2.2.9 CCK-8试验检测药物对Vero E6及ST细胞活性的检测 |
| 2.2.10 siRNA干扰 |
| 2.2.11 蛋白过表达或siRNA干扰对病毒复制影响 |
| 2.2.12 SADS-CoV滴度的测定 |
| 2.2.13 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SADS-CoV感染Vero E6细胞后自噬小体的形成 |
| 2.3.2 SADS-CoV感染Vero E6细胞后自噬囊泡的形成 |
| 2.3.3 SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞后LC3蛋白的转化 |
| 2.3.4 SADS-CoV复制过程参与诱导细胞自噬 |
| 2.3.5 诱导自噬促进SADS-CoV的复制,而抑制自噬降低SADS-CoV的复制 |
| 2.3.6 敲低自噬关键因子ATG5和LC3B降低SADS-CoV的复制 |
| 2.3.7 SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞引起自噬底物p62的降解 |
| 2.3.8 SADS-CoV感染Vero E6诱导autolysosome的形成 |
| 2.3.9 SADS-CoV感染Vero E6后LysoTracker初LC3共定位分析 |
| 2.3.10 SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞LC3-Ⅱ周转分析 |
| 2.3.11 SADS-CoV感染诱导内质网应激并激活PERK-EIF2S1、IRE1和ATF6三条通路 |
| 2.3.12 内质网应激参与SADS-CoV诱导的细胞自噬 |
| 2.3.13 PERK-EIF2S1通路抑制SADS-CoV复制,但不参与SADS-CoV诱导的细胞自噬 |
| 2.3.14 ATF6信号通路不影响SADS-CoV的复制及SADS-CoV诱导的细胞自噬 |
| 2.3.15 SADS-CoV通过激活IRE1信号通路诱导细胞自噬促进SADS-CoV的复制 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 SADS-CoV感染诱导细胞自噬 |
| 2.4.2 细胞自噬促进SADS-CoV的复制 |
| 2.4.3 SADS-CoV感染诱导完整的自噬潮 |
| 2.4.4 SADS-CoV感染诱导内质网应激,并通过IRE1通路激活细胞自噬促进病毒的复制 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）SARS-CoV刺突蛋白嵌合型重组VSV的构建与免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 重症急性呼吸综合征的研究进展 |
| 1.1.1 重症急性呼吸综合征的病原学 |
| 1.1.2 重症急性呼吸综合征的流行病学 |
| 1.1.3 重症急性呼吸综合征的临床表现 |
| 1.1.4 重症急性呼吸综合征的发病机制 |
| 1.1.5 重症急性呼吸综合征的诊断与防控 |
| 1.2 重症急性呼吸综合征病毒的分子生物学特性 |
| 1.2.1 SARS-Co V概述 |
| 1.2.2 SARS-Co V S蛋白的结构功能特点 |
| 1.3 重症急性呼吸综合征病毒疫苗研究进展 |
| 1.3.1 灭活病毒疫苗 |
| 1.3.2 减毒活疫苗 |
| 1.3.3 DNA疫苗 |
| 1.3.4 亚单位疫苗 |
| 1.3.5 重组病毒载体疫苗 |
| 1.4 水泡性口炎病毒 |
| 1.4.1 水泡性口炎病毒概述 |
| 1.4.2 水泡性口炎病毒的形态和基因组结构 |
| 1.4.3 水泡性口炎的症状和流行病学 |
| 1.4.4 水泡性口炎病毒作为活病毒疫苗载体 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 表达SARS-Co V S蛋白嵌合型重组VSV的构建与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞和血清 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 主要实验试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 表达SARS-Co V S蛋白嵌合型重组VSV全长c DNA的构建 |
| 2.2.1.1 引物设计与SARS-Co V S蛋白片段合成 |
| 2.2.1.2 SARS-Co V S蛋白基因的扩增和序列分析 |
| 2.2.1.3 表达S蛋白的嵌合型重组VSV基因组全长c DNA的构建 |
| 2.2.1.4 表达e GFP重组S蛋白嵌合型VSV基因组全长c DNA的构建 |
| 2.2.2 两种重组病毒的拯救 |
| 2.2.3 两种重组病毒的鉴定 |
| 2.2.3.1 RT-PCR鉴定 |
| 2.2.3.2 S蛋白在感染细胞中的表达 |
| 2.2.3.3 S蛋白的激光共聚焦鉴定 |
| 2.2.3.4 IFA研究重组病毒的入侵细胞方式 |
| 2.2.3.5 重组病毒的形态及S蛋白在病毒颗粒表面的分布 |
| 2.2.4 病毒的体外生长动力学曲线检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 表达S蛋白嵌合型重组VSV基因组全长c DNA的构建 |
| 2.3.2 表达e GFP重组S蛋白嵌合型VSV基因组全长c DNA的构建 |
| 2.3.3 两种重组病毒的拯救 |
| 2.3.4 两种重组病毒的鉴定 |
| 2.3.4.1 RT-PCR |
| 2.3.4.2 Western blot验证S蛋白在感染细胞中的表达 |
| 2.3.4.3 S蛋白的激光共聚焦 |
| 2.3.4.4 IFA研究重组病毒的入侵细胞方式 |
| 2.3.4.5 重组病毒的形态特征及S蛋白在病毒颗粒表面的分布 |
| 2.3.5 病毒的体外生长动力学曲线检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 动物免疫试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒、细胞、质粒和实验动物 |
| 3.1.2 主要实验试剂和仪器 |
| 3.1.3 多肽的合成 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 小鼠的免疫试验 |
| 3.2.1.1 小鼠的安全性试验 |
| 3.2.1.2 小鼠的免疫试验 |
| 3.2.1.3 小鼠血清的中和抗体测定 |
| 3.2.1.4 小鼠血清ELISA实验 |
| 3.2.2 恒河猴免疫试验 |
| 3.2.2.1 恒河猴血清的中和抗体测定 |
| 3.2.2.2 恒河猴血清ELISA实验 |
| 3.2.2.3 PBMCs的分离 |
| 3.2.2.4 ELISPOT实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 VSVΔG-SARS对小鼠的安全性 |
| 3.3.2 VSVΔG-SARS诱导小鼠中和抗体效价测定 |
| 3.3.3 VSVΔG-SARS诱导小鼠血清Ig G水平测定 |
| 3.3.4 VSVΔG-SARS诱导恒河猴中和抗体效价测定 |
| 3.3.5 VSVΔG-SARS诱导恒河猴血清Ig G水平测定 |
| 3.3.6 CTL细胞表位肽筛选分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）冠状病毒感染调控细胞凋亡机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 冠状病毒分类及特征 |
| 2 冠状病毒诱导细胞凋亡途径 |
| 2.1 冠状病毒通过外在途径诱导侵染细胞凋亡 |
| 2.2 冠状病毒通过内在途径诱导侵染细胞凋亡 |
| 2.3 冠状病毒通过NF-κB信号途径诱导细胞凋亡 |
| 3 冠状病毒抑制侵染细胞凋亡作用 |
| 4 总结 |
| 5 讨论 |
四、SARS-CoV感染Vero E6细胞诱导细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]新型冠状病毒干扰宿主细胞自噬过程及其潜在治疗靶点研究[D]. 尚超. 军事科学院, 2021
- [2]靶向新型冠状病毒包膜蛋白的小分子抑制剂发现[D]. 王翼. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2021(08)
- [3]猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导宿主细胞凋亡的分子机制[D]. 张记宇. 中国农业科学院, 2021
- [4]PEDV流行毒株JS2013诱导Vero细胞凋亡[J]. 梁荣,宋海鑫,黄佳玲,费荣梅,张金秋. 南京农业大学学报, 2021(03)
- [5]猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬的机制研究[D]. 石达. 中国农业科学院, 2020(01)
- [6]SARS-CoV刺突蛋白嵌合型重组VSV的构建与免疫原性研究[D]. 汤筱艳. 中国农业科学院, 2020(01)
- [7]Advance in human coronaviruses research of host interactions[J]. Gu Yanni,Shen Chaobin,Chen Tongxin. Chinese Journal of Applied Clinical Pediatrics, 2020(02)
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