根瘤菌1201菌株合成多聚羟基烷酸和多糖的研究

论文摘要

本文对根瘤菌1201菌株生长条件以及次级代谢产物多聚羟基烷酸和多糖进行了系统的研究。其主要结果如下: 1、通过摇瓶正交试验确定了最佳培养基配方和最适培养条件,应用10-L自动控制发酵罐在优化条件下进行分批发酵实验得到了一系列分批发酵动力学参数。试验结果表明,最佳培养基的成分和成分含量分别为蔗糖（5g/L）、（NH4）2SO4（0.6g/L）、豆芽汁（5%）、KH2PO4·12H2O（0.61g/L）、K2HPO4（0.39g/L）、CaCl2（0.1g/L）、微量元素（H3BO3,5g/L;Na2MoO4,5g/L）,4ml/L,最适培养条件初始pH为7.0、温度为30℃、溶氧为（100mL/250mL）。通过32小时分批发酵,细胞干重（CDW）最高产量为17.84182干细胞g/L,平均生长速率0.6608g·L-1·h-1,最大生长速率2.217g·L-1·h-1;平均耗糖、耗氮、耗磷速率分别为0.9935g·L-1·h-1、0.1064g·L-1·h-1、0.0107g·L-1·h-1;菌体对蔗糖得率系数（Yx/g）0.5892g/g,菌体对NH4+得率系数（Yx/n）g/g 8.5388,菌体对P得率系数（Yx/p）76.673g/g,发酵周期为27小时。该菌株在优化的培养条件下,生长速率快,能耗底,不产生色素、毒素,是一株生产性状优良的生产菌株。 2、分批发酵表明根瘤菌1201合成多聚羟基丁酸（PHB）与细胞生长的关系为部分生长关联型,PHB最高产量为6.61g/L。在此基础上,以烷酸盐作为调节剂,进行了代谢调控,获得了羟基丁酸和羟基辛酸共聚体[P（HB-HO）]和另一种类型的多聚羟基烷酸。在含有蔗糖培养基中加入月桂酸盐可合成多聚羟基丁酸和辛酸共聚体[poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxy-octanoate）,简称P（HB-HO）],摇瓶正交试验表明月桂酸盐浓度对干细胞中P（HB-HO）的含量有极显著的影响,随着月桂酸盐浓度的增加,P（HB-HO）的含量随之增加。由于月桂酸盐对菌体细胞生长有抑制作用所以我们选择在生长对数后期加入月桂酸盐。这样可以依照生产需求调整月桂酸盐浓度来影响干细胞中P（HB-HO）的含量。采用溶剂萃取法和水相分离法对根瘤菌1201菌株合成的多聚羟基丁酸（PHB）进行了提取,溶剂萃取结果表明:在不同萃取剂选择中氯仿是最佳萃取剂,氯仿萃取PHB最适提取时间2-4h最佳。水相分离法采用的碱法、酸法、NaClO-CHCl3等方法均未得到满意结果。以氯仿为萃取剂进行单级、三级错流和五级逆流三种萃取方式中,五级逆流萃取得到的产物中PHB收率和纯度最高。在实验的基础上初步得到了提取流程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1. 研究目的和意义
• 2. 技术路线
• 第一部分 文献综述
• 1. 多聚羟基烷酸的研究进展
• 1.1 多聚羟基烷酸的开发与利用
• 1.2 多聚羟基烷酸的生物学特性
• 1.3 合成多聚羟基烷酸的主要微生物
• 1.4 发酵工艺与生产
• 1.5 下游提取与加工
• 1.6 PHAs的检测和分析
• 1.7 多聚羟基烷酸的分子结构与性质
• 1.8 合成多聚羟基烷酸的代谢途径及调节控制
• 1.9 多聚羟基烷酸的应用与前景展望
• 2. 多糖的研究进展
• 2.1 多糖免疫调节作用的研究进展
• 2.2 EPS的分离纯化及结构研究
• 第二部分 根瘤菌1201菌株生长条件优化的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 培养基成分与培养条件对 Rhizobium sp．1201的影响
• 1.2.3 分批发酵动力学参数测定
• 2. 结果与分析
• 2.1 最适培养基成分及生长条件的优化
• 2.2 发酵动力学参数
• 3. 讨论与结论
• 第三部分 根瘤菌1201合成多聚羟基烷酸的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 合成 PHB的分批发酵
• 1.2.2 多聚羟基烷酸的诱导合成
• 1.2.3 提取根瘤菌1201细胞内 PHB方法的研究
• 1.2.4 不同萃取方式提取根瘤菌1201细胞内 PHB的研究
• 1.2.5 PHAs的分子量测定:乌氏粘度计法
• 2. 结果与分析
• 2.1 多聚羟基丁酸合成与菌体生长关系
• 2.2 底物诱导合成多聚羟基烷酸
• 2.2.1 烷酸盐诱导合成多聚羟基烷酸
• 2.2.2 诱导合成羟基丁酸和羟基辛酸共聚体的最优条件
• 2.3 不同方法提取根瘤菌1201细胞内 PHB
• 2.3.1 有机溶剂萃取 PHB法条件的筛选
• 2.3.2 水相提取 PHB结果比较
• 2.4 萃取方式的比较
• 2.5 PHB、P（HB-HO）的分子量大小
• 3. 讨论与结论
• 第四部分 根瘤菌1201菌株胞外多糖的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器设备
• 1.1.4 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 合成多糖的分批发酵
• 1.2.2 发酵液与菌体分离方法比较研究
• 1.2.3 粗多糖的制备
• 1.2.4 粗多糖单糖成分测定
• 1.2.5 根瘤菌1201胞外多糖对小鼠非特异性免疫功能的影响
• 2. 结果与分析
• 2.1 多糖合成与菌体生长的关系
• 2.2 最佳固液分离方法的筛选
• 2.3 粗多糖单糖成分
• 2.4 根瘤菌1201胞外多糖对小鼠非特异性免疫功能的增强作用
• 3. 讨论与结论
• 结束语
• 参考文献
• 致谢