论文摘要
背景:心源性猝死严重危害人类健康,发病率高达0.1%-0.2%,仅在美国每年就可导致大约30万-40万人死亡。90%猝死的患者可以找到心脏病因,由于猝死后存活的患者有限,因此至少5%患者没有潜在的心脏病原因,这些患者大多数年龄小于40岁,其中长QT综合征是引起这部分病人猝死的主要原因之一。长QT综合征又称心室复极延长综合征,其特征性表现是心电图上QT间期延长, T波异常,易产生尖端扭转型室速和室颤。长QT综合征按病因通常可分为获得性和遗传性两种类型。获得性长QT综合征虽也具有遗传易感性,但主要与心肌局部缺血、电解质紊乱和应用某些药物等因素有关,临床上祛除这些诱发因素常可有效治疗。而遗传性长QT综合征的发生机制要复杂得多,又无有效的治疗措施,因此长期以来一直是心律失常领域的研究焦点。从Jervell和Lange-Nielsen于1957年在世界上报道了第一个呈常染色体隐性遗传的长QT综合征家系,至今已经已经发现了10个基因的数百个突变可导致10种不同类型的长QT综合征,初步揭示了部分长QT综合征的分子缺陷及其作用机制。然而,已经识别出的10个长QT综合征致病基因只可以解释大约80%的长QT综合征患者的病因和发病机制,仍有20%左右的长QT综合征患者的致病基因有待识别。不仅如此,由于长QT综合征既具有显著地遗传异质性,不同患者的致病基因不一定相同,即使基因相同,致病突变也多不同;同时存在巨大的表型差异,同样是长QT综合征患者,有的毫无症状,有的则出现晕厥和猝死等表现,因而有必要对所有无血缘关系的长QT综合征尤其是家族性长QT综合征患者进行分子学遗传研究。目的:定位新的家族性长QT综合征的致病基因座,识别新的家族性长QT综合征的致病基因,并在细胞水平研究其作用机制,为长QT综合征的早期诊断、预后评估、预防咨询以及基因治疗奠定基础。方法:收集长QT综合征家系和无血缘关系的健康对照者。采集外周静脉血,常规抽提基因组DNA。在前期已经排除了所报道的10个长QT综合征相关基因KCNQ1、KCNH2、SCN5A、Ankyrin B、KCNE1、KCNE2、KCNJ2、CACNA1C、CAV3和SCN4B的基础上,进行微卫星全基因组扫描、基因分型、单倍型和连锁分析,确定候选基因在染色体上的座位。运用生物信息学知识确定所定位区域的首选候选基因,通过PCR-测序和序列比对分析以期发现家族性长QT综合征先证者的基因突变。然后,分别在发生基因突变的家系和健康对照者中筛查所发现的突变基因,以评估该基因突变在不同人群中的流行率,并对比分析突变区域氨基酸在各物种间的保守性,初步确定所发现的突变是致病突变而不是罕见的分子多态。运用分子克隆技术克隆所发现的潜在致病基因的野生型,插入到克隆载体pGEM-T,针对所发现的突变通过定位诱变获得该基因的突变体,再通过酶切反应及测序证实后转化感受态细胞,中量制备所识别出的长QT综合征基因的重组质粒,在体外逆转录制备适量的野生型和突变型长QT综合征基因的cRNA,通过显微注射装置注入爪蟾卵母细胞,运用双电极电压钳在细胞水平研究突变基因产物所发生的电生理改变。结果:获得了一个长QT综合征大家系和500例无血缘关系的健康对照者的临床资料和血标本,绘制了该家系的系谱图,抽提了基因组DNA。通过微卫星全基因组扫描获得了家系成员的基因型,构建了单倍型图。通过连锁分析,确定该家系长QT综合征的候选基因在染色体上的座位是11q23-24（在11号染色体上,两标记位点D11S990和D11S4123之间的5.34cM的间隔区域,其中在位点D11S4123在θ=0.00时得到最大的LOD值5.4183）。运用生物信息学知识确定所定位区域的首选候选基因为KCNJ1和KCNJ5,通过PCR-测序和序列比对分析发现家族性长QT综合征先证者的KCNJ5基因发生了一个改变氨基酸的杂和错义突变,即KCNJ5基因（基因登录号NM000890）第1473位的鸟嘌呤（即第387位密码子的第一个核甘酸）变成了胞嘧碇（1473 G C）,相应地其所编码的离子通道蛋白的第387位的甘氨酸变成了精氨酸（Gly387 Arg）。相同的突变存在于家系中所有的患者,但500例无血缘关系的健康对照者均无此突变,也没有在该家族性长QT综合征先证者中发现KCNJ1基因存在突变。多物种序列比对显示KCNJ5基因Gly387 Arg突变具有高度保守性,初步确定所发现的突变是致病突变而不是罕见的分子多态。运用分子克隆技术成功克隆了所发现的潜在致病基因KCNJ5的野生型,插入到克隆载体pGEM-T,针对所发现的突变通过定位诱变获得该基因的突变体,再通过酶切反应及测序证实后中量制备了该基因的重组质粒,在体外逆转录制备了适量的野生型和突变型KCNJ5的cRNA,通过显微注射装置注入爪蟾卵母细胞,全细胞双电极电压钳研究发现KCNJ5的Gly387 Arg突变为功能获得性,使KCNJ5基因所编码的钾离子通道在所有电压水平的电流密度均大幅度升高,在-50mV,突变型KCNJ5和野生型KCNJ5的电流密度分别为- 23.2±1.2pA/pF（ n= 11）和- 8.5±0.8pA/PF（ n= 8） （p<0.05）;电压为-20mV时,两者的电流密度分别为15.2±1.1pA/pF（n=11）和5.1±0.5 pA/pF（n=8）（p<0.05）。结论:确定了一个新的长QT综合征致病基因座11q23-24,识别了一个新的长QT综合征致病基因KCNJ5,KCNJ5基因Gly387 Arg突变对KCNJ5基因所编码的钾离子通道的功能具有显著影响。