放射联合基因治疗肿瘤相关性p53突变子实验研究

论文摘要

p53基因是一种重要的抑癌基因,在细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞凋亡及抑制肿瘤的发生等方面发挥着重要的作用。人类肿瘤的发生与p53基因的突变有着密切的联系,人类50%以上的肿瘤发生伴随着p53基因的突变,其中74%是错义突变,而且p53基因的突变与病情的发展,肿瘤的转移以及对放疗、化疗的敏感性和预后都密切相关。有研究表明,大多数的突变型p53可以与p53的靶基因启动子结合而抑制野生型p53的功能,突变的p53对野生型p53有显著的负效应,并且部分突变的p53有内在的致癌特性。如何封闭肿瘤相关性p53杂合突变成为突破口和关键,为肿瘤的基因治疗提供了新思路。本实验主要应用RNA干扰（RNA interference,即RNAi）原理,研究特异性发夹环RNA（Small hairpin RNA,shRNA）对突变型p53（mtp53）的沉默效果以及联合应用放射治疗对shRNA发挥干扰效果的影响。RNAi是生物体内固有的机制,即在转录后水平进行基因沉默。RNAi具有高效、特异性强的特点,应用于治疗可以回避其他基因治疗的缺点和不确定性。实验选取与中国人肿瘤发生密切相关的p53突变子175H为研究对象,采取引物重叠PCR定点突变技术及基因重组技术构建突变子表达载体并应用脂质体转染法将其转入肺腺癌细胞株H1299,构建突变子细胞模型。在模型中观察突变子基因沉默的效果,同时联合应用X射线照射,对比联合治疗与单纯RNAi治疗的封闭效应。实验结果表明:1.构建的突变子表达载体PcDNA3.1-175H具有生物活性,在H1299细胞中表达出了p53突变蛋白;2.针对突变子175H设计的特异性shRNA及构建的逆转录病毒表达载体能够有效发挥基因沉默的功能;3.联合应用放射治疗后对shRNA沉默的功能未见明显的影响。因此,应用RNAi技术能够达到有效沉默突变型p53（mtp53）的目的,放射治疗的联合作用有待进一步优化。以上实验结果,将为肿瘤治疗研究提供依据,并为进一步的实验研究奠定了基础。

论文目录

• 内容提要
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 p53基因的结构
• 2 p53的功能
• 2.1 G1、G2期阻滞
• 2.2 DNA修复
• 2.3 细胞死亡
• 3 p53的靶基因及调控p53的基因
• 3.1 p53的靶基因
• 3.2 调控p53的基因
• 4 p53基因与肿瘤
• 4.1 wtp53抗肿瘤的作用机制
• 4.2 肿瘤相关性p53基因突变
• 4.3 p53基因突变分类
• 5 肿瘤p53基因治疗
• 5.1 肿瘤的p53基因治疗
• 5.2 RNAi技术
• 6 肿瘤放射联合p53基因治疗
• 7 本课题研究的意义及前景展望
• 第二章 材料与方法
• 1 主要试剂及器材
• 1.1 试剂
• 1.2 器材
• 1.3 主要仪器
• 2 细胞株培养
• 2.1 细胞株
• 2.2 细胞培养试剂的配制
• 2.3 细胞冻存及复苏
• 3 表达载体的构建
• 3.1 试剂配制
• 3.2 突变子表达载体构建
• 3.3 shRNA表达载体的构建
• 4 突变子细胞模型的建立
• 5 突变子基因沉默
• 5.1 试剂的配制
• 5.2 磷酸钙共沉淀法转染
• 6 蛋白质免疫印记法（Western Blot）
• 6.1 试剂的配制
• 6.2 总蛋白提取
• 6.3 蛋白浓度测定—标准曲线法
• 6.4 Western Blot
• 7 照射条件
• 第三章 实验结果
• 1 突变子175H表达载体的构建
• 1.1 基因定点突变
• 1.2 载体线性化回收
• 1.3 载体连接和扩增
• 1.4 pcDNA3.1-175H测序结果
• 2 Psuper-175HR载体构建
• 2.1 psuper.retro.puro载体的线性化
• 2.2 Psuper-175HR载体构建
• 3 突变子细胞模型和基因沉默检测
• 3.1 突变子细胞模型构建
• 3.2 基因沉默检测
• 4 突变子细胞模型时程影响
• 5 突变子细胞模型量效影响
• 6 突变子细胞模型基因沉默后时程影响
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果
• 导师简介
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract