极细链格孢菌糖基化激活蛋白的纯化及其电喷雾质谱的分析

论文摘要

从极细链格孢菌（Alternaha tenuissima）提取出来的激活蛋白具有诱导植物系统抗性的活性，SDS-PAGE显示主要有三个蛋白质条带，分子量分别为33kD，42kD和66kD。前期研究已证明，分子量为66kD左右的蛋白为糖蛋白，为了进一步研究该糖蛋白的性质及其作用机理，本文通过层析法等多种方法对该蛋白进行了纯化，获得了银染电泳级的纯品；利用TFMS化学法切除了O-连接的糖基，分析了其糖基修饰位点；在标准蛋白高效液相色谱-电喷雾质谱（HPLC-ESI-MS）分析技术体系基础上，建立了该糖基化激活蛋白的HPLC-ESI-MS分析体系，获得了精确分子量，经蛋白数据库搜索，初步推测该糖基化激活蛋白为一新型蛋白。具体结果如下：用硫酸铵沉淀法结合乙醇沉淀法去除了影响蛋白纯化的真菌多糖，优化了柱层析纯化的缓冲液和洗脱条件，通过DEAE阴离子交换层析技术和梯度洗脱方式，以及Superdex75 10／300凝胶过滤层析纯化，获得了银染电泳纯的单一蛋白条带；利用液相等电聚焦结合SDS-PAGE技术，测得该糖基化蛋白的等电点为4.27。采用TFMS化学法去除了该糖基化激活蛋白O-连接的糖基，SDS-PAGE结果显示切除后的蛋白呈现两条带，初步推测该糖基化激活蛋白至少存在两个糖基修饰位点。建立了标准蛋白溶菌酶和BSA的HPLC-ESI-MS蛋白分析体系，测定了溶菌酶的精确分子质量14310.7Da和BSA酶解片段的RP-HPLC-ESI-MS谱图，并通过MASCOT搜索得到正确鉴定。建立了HPLC-ESI-MS分析糖基化激活蛋白的技术体系，测定了该糖基化激活蛋白的相对分子质量为50270D，获得了其RP-HPLC-ESI-MS谱图，经数据库搜索，没有发现较高匹配，初步推测其为一新型蛋白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究概述
• 1.2 蛋白激发子种类及其在国内外研究进展
• 1.2.1 过敏蛋白 Harpin
• 1.2.2 激发素 Elicitins
• 1.2.3 激活蛋白 （Activator）
• 1.3 糖蛋白的结构功能及糖基化分析方法
• 1.3.1 蛋白质糖基化的主要类型
• 1.3.2 糖基化发生的特点及其分析技术的难点
• 1.3.3 蛋白质糖基化研究的内容、技术和策略
• 1.3.4 糖蛋白鉴定/糖基化位点确定方法
• 1.4 电喷雾质谱在生物样品分析中的应用
• 1.4.1 电喷雾电离过程
• 1.4.2 电喷雾电离质谱的分子质量的检测
• 1.4.3 电喷雾电离质谱用于多肽与蛋白质分析
• 1.5 高效液相色谱-质谱联用在激发子研究中的应用
• 1.6 研究目的和意义
• 第二章 糖基化激活蛋白的纯化及其理化性质的分析
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 试剂与材料
• 2.1.2 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）的培养与激活蛋白粗提液的制备
• 2.2.2 激活蛋白的粗分离
• 2.2.3 蛋白浓度测定方法
• 2.2.4 糖基化激活蛋白的等电点分析
• 2.2.5 糖基化激活蛋白柱层析纯化方法的建立
• 2.2.6 糖基化激活蛋白的确定与去糖基化
• 2.2.7 糖基化激活蛋白的生物活性测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 糖基化激活蛋白的等电点
• 2.3.2 糖基化激活蛋白的柱层析纯化结果
• 2.3.3 糖基化激活蛋白的去糖基化
• 2.3.4 糖基化激活蛋白的生物活性测定
• 2.4 小结
• 第三章 模式蛋白溶菌酶和 BSA的高效液相-电喷雾质谱分析
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 试剂、材料
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 生物样品
• 3.2 方法
• 3.2.1 溶剂及酸度的选择和仪器参数的优化
• 3.2.2 标准样品的HPLC分析
• 3.2.3 牛血清白蛋白（BSA）的酶解
• 3.2.4 标准蛋白的质谱分析条件
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 溶剂及酸度的选择
• 3.3.2 仪器工作条件优化
• 3.3.3 标准蛋白纯品和混合物的HPLC分析结果
• 3.3.4 电喷雾质谱测定溶菌酶的相对分子质量
• 3.3.5 BSA酶解片段的ESI质谱分析结果
• 3.4 小结
• 第四章 糖基化激活蛋白的 HPLC-ESI-MS分析技术体系的建立
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 试剂、材料
• 4.1.2 仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 HPLC分析条件
• 4.2.2 质谱条件
• 4.2.3 糖基化激活蛋白的酶解
• 4.2.4 数据分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 糖基化激活蛋白的HPLC分析
• 4.3.2 利用ESI质谱测定糖基化激活蛋白的相对分子质量
• 4.3.3 糖基化激活蛋白酶解产物的RP-HPLC分离及ESI质谱分析
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历