论文摘要
研究目的：观察WT1基因及蛋白在白血病细胞中的表达及亚细胞定位情况,研究WT1蛋白抑制剂一姜黄素,对白血病细胞（尤其是慢粒急变细胞系-K562）增殖能力的影响,并探讨相关机制。采用RNA干扰技术,以WT1特异性shRNA下调WT1的表达,观察细胞的增殖能力、自我更新能力、细胞周期、凋亡及分化等生物学效应,进一步探究WT1与白血病细胞生物学特征改变相关的机制。研究方法：采用Real time-PCR和Western blot方法观察WT1 mRNA及蛋白在不同白血病细胞系中的表达及亚细胞定位,同时采用免疫细胞化学方法观察WT1的亚细胞定位。Chromatin ImmunoPrecipitation-DNA Selection and Ligation （ChIP-DSL）方法用于寻找WT1可能的转录调控靶基因。MTT方法观察细胞的增殖并绘制增殖曲线、观察姜黄素对细胞生长的抑制作用及与格列卫、依托泊甙（VP-16）的协同作用,计算增殖抑制率。采用流式细胞技术检测细胞周期、凋亡及分化等相关指标。设计WT1特异的短发夹RNA（即WT1-shRNA）片段,构建pLKO.1-puro载体,转染293T细胞,包装慢病毒,感染K562细胞,进而检测WT1基因下调后细胞生物学效应的改变,同时分析WT1可能的靶基因—Wnt/β、-catenin信号通路相关基因的变化。结果：WT1基因在多种白血病细胞系中表达（U937细胞除外）,尤其以K562细胞高表达；Western blot及细胞免疫荧光均提示WT1蛋白在细胞核及胞浆中均有分布,以胞浆中为主。因K562细胞高表达WT1,且为慢粒急变细胞系,对多种常规化疗药物不敏感,故后续实验研究集中在K562细胞进行：1、采用WT1蛋白抑制剂—姜黄素处理细胞,发现其明显抑制细胞的增殖,呈剂量、时间依赖性,其IC50值在24、48及72小时分别为28.15μM、33.79μM及38.12μM。姜黄素联合慢粒治疗的靶向药物—酪氨酸激酶抑制剂-格列卫,二者具有协同抗白血病细胞增殖的作用。检测细胞表面分化抗原发现,姜黄素处理后CD13表达明显增加,CD11b稍有增加,提示姜黄素有促使细胞向成熟阶段分化的潜能；细胞周期分析发现,姜黄素使G2/M期细胞比例较对照组明显增高（7.11±2.46 vs28.50±3.49）,而G0/G1期及S期细胞比例减低。2、设计针对WT1基因的特异shRNA,下调K562细胞中WT1基因的内源表达,发现：WT1-shRNA干扰组细胞增殖能力减弱、集落形成能力明显减低,但无明显细胞凋亡及分化趋势；细胞周期分析发现,干扰组G0/G1期细胞比例明显增加,而S期比例减低；联合药物实验发现,WT1-shRNA干扰组细胞对VP-16更敏感,其增殖抑制作用强于对照组。3、进一步探讨WT1在白血病发生中的相关作用机制,ChIP-DSL启动子芯片分析结果显示,WT1参与多种信号通路相关基因的转录调控,其中主要包括Wnt/β-catenin信号通路中的多个基因；MAPK信号通路相关基因；凋亡及细胞周期调控相关基因等。结合ChIP-DSL结果,重点研究Wnt/β-catenin信号通路中的相关基因,实验观察到：（1）姜黄素处理细胞24及48小时后,实时定量PCR检测发现Wnt非经典途径重要基因—SUZ12 mRNA下调50-60%,其蛋白水平表达也下调达30%左右,而Wnt途径其它相关基因,如Wnt3a、Wnt5a, Wntll及β-catenin在mRNA及蛋白水平均上调（有的达2倍以上）。（2）WT1-shRNA特异性下调WT1基因后,经典及非经典途径的多数基因如β-catenin、SUZ12、Wnt11在mRNA及蛋白水平均明显下调,而Wnt3a、Wnt5a稍有升高。同时发现,β-catenin的亚细胞定位亦发生改变,其直接靶基因CCND1及MYC的表达也明显下调,这可能是WT1干扰后细胞周期出现G0/G1期阻滞的原因。结论：1.WT1基因在多种白血病细胞系高表达。2.WT1蛋白抑制剂一姜黄素能明显抑制白血病细胞的增殖及集落形成能力,具有诱导K562细胞向较成熟阶段分化的潜能,使细胞阻滞于G2/M期。姜黄素联合酪氨酸激酶抑制剂—格列卫有协同抗增殖作用,二者均可明显降低BCR/ABL p210融合基因的拷贝数,以上在慢性粒细胞白血病的临床诊治工作中将具有重要意义。3.采用RNA干扰技术下调WT1后,K562细胞的增殖及集落形成能力明显下降,对化疗药物的敏感性增加。4. WT1基因是白血病发生发展过程中的一种重要癌基因,至少部分功能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路而实现的。
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