骨髓间充质干细胞上清液的体内外实验研究

论文摘要

目的:本实验研究旨在探讨BMSCs的移植机制,主要包括以下两个方面:①检测人骨髓间充质干细胞（Human Bone Marrow Stromal Cells,hBMSCs）向神经细胞诱导分化前后培养液上清中NGF含量,观察其变化情况;探讨hBMSCs在传代培养过程和向神经细胞分化过程中的分泌作用及其机制。②观察骨髓间充质干细胞上清液经尾静脉注射治疗大鼠脑缺血后第七天原位神经前体细胞的增殖、分化情况以及大鼠神经功能改善情况,评价上清液治疗价值并探讨骨髓间充质干细胞移植之后体内作用机制。方法:从健康志愿者髂骨处抽取骨髓5ml,在体外进行分离、培养、扩增、传代,当传至第5代时,分别收集1d、3d、5d、7d上层培养液,使用ELISA法检测以上各时间点hBMSCs培养液上清中NGF的浓度,然后用400ng/L音猥因子（Sonic hedhehog,Shh）、0.5μM维甲酸（Retinoic acid,Ra）和5μM福斯克林（Forskolin,Fn）组成的诱导体系对hBMSCs进行诱导,检测诱导前（12h、1d、3d）和诱导后（12h、1d、3d）的上清液中NGF含量,观察其变化;选取16只健康Wistar大鼠随机分为假手术组、缺血对照组、上清液低浓度组、上清液高浓度组,后三组建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型（MCAO）,模型制作24h后各组腹腔注射5-溴脱氧尿核苷（bromodeoxyuridine,BrdU）用以标记处于增殖状态的神经前体细胞,应用免疫组织化学染色检测缺血后7d脑组织BrdU、BrdU+NSE、BrdU+GFAP阳性细胞数。对缺血对照组、上清液低浓度组、上清液高浓度组三组大鼠在上清液干预治疗前后进行神经功能评分,结果进行统计学分析。结果:hBMSCs培养液中含有NGF,随着培养时间的延长,培养液中NGF的浓度增加;hBMSCs后期诱导液中也含有NGF,且诱导后各时间点（12h、1d、3d）浓度均明显高于诱导前（12h、1d、3d）（P<0.01）。使用hBMSCs培养上清液干预治疗,脑梗死后7d侧脑室室管膜下区、海马齿状回区BrdU、BrdU+NSE、BrdU+GFAP阳性细胞数开始增多,且上清液高浓度组的上述阳性细胞数明显多于对照组（P<0.05）和低浓度组（P<0.05）。使用BMSCs上清液干预治疗的7d时间内,相同时间点（1d、4d、7d）在缺血对照组、上清液低浓度组、上清液高浓度组大鼠之间两两比较,神经功能评分无统计学差异（P >0. 05）;同一组内大鼠不同时间点（1d、4d、7d）两两比较,神经功能评分无统计学差异（P >0. 05）。结论:①hBMSCs在贴壁培养过程中可向外分泌NGF等神经营养因子,在有限的时间内,NGF的浓度随着培养时间增加而增加,提示与贴壁培养细胞扩增有关②使用诱导剂后,hBMSCs在向神经细胞分化的过程中,NGF的浓度明显高于诱导前,提示由Shh、Ra、Fn组成的诱导体系可以明显促进分化过程中hBMSCs的分泌作用。③hBMSCs上清液干预治疗后,可以促进脑梗死大鼠损伤原位内源性神经前体细胞的增殖、分化,具有潜在的治疗价值。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 hBMSC 向神经细胞分化前后表达神经生长因子的变化
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 讨论
• 第二章 hBMSC 上清液治疗大鼠脑缺血的实验研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 个人简历
• 致谢