论文摘要
目的研究诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）选择性抑制剂1400W对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法1.体外正常培养条件下,分别采用不同浓度（12.5,25, 50, 100, 200 ,400μmol/L）的1400W对SMMC-7721细胞分别进行干预,24h,48h,72h后,采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测各组人肝癌细胞株SMMC-7721体外增殖的改变;流式细胞仪（FCM）分析各组人肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期及细胞凋亡的变化;硝酸还原酶法测定各组人肝癌细胞株SMMC-7721培养上清液中一氧化氮（Nitric oxide NO）水平变化;RT-PCR检测各组人肝癌细胞株SMMC-7721中iNOS和VEGF mRNA含量的改变。2.体外缺氧培养条件下,根据MTT结果,分别采用不同浓度（50, 100, 200μmol/L）的1400W对SMMC-7721细胞分别进行干预,24h后用硝酸还原酶法测定各组人肝癌细胞株SMMC-7721培养上清液中NO水平;RT-PCR检测各组人肝癌细胞株SMMC-7721中iNOS和VEGF mRNA的含量改变。结果1. MTT检测结果显示,不同浓度1400W对细胞生长均有抑制作用,且同一时间各组与对照组相比差异有显著性（P<0.05）;1400W对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用呈一定的剂量-时间效应依赖关系。50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l1400W作用细胞72h后抑制率分别为16.42%、25.37%、31.34%、34.33%。2.细胞周期分析显示,50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l 1400W处理细胞48h后,与对照组相比,G0/G1期细胞明显增多（P<0.05）,S期细胞明显减少（P<0.05）,且1400W浓度越高,该作用越强,其中200μmol/l 1400W处理细胞48h后, G0/G1期细胞为76.48%±0.14,S期细胞为18.34%±0. 20;同时1400W还能诱导SMMC-7721细胞凋亡, 100μmol/l、200μmol/l 1400W处理细胞48h后凋亡率分别为4.52%±0.28、9.14%±0.31。提示,不同浓度1400W对细胞生长抑制作用可能与细胞生长周期受抑制有关。3.硝酸还原酶法检测结果显示,体外常规条件培养下,不同浓度1400W处理细胞后,对细胞NO释放均有抑制作用,且同一时间各组与对照组相比差异有显著性（P<0.05）,1400W对SMMC-7721细胞NO释放的抑制作用,在实验范围内呈剂量-时间效应依赖关系;其中50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l 1400W作用细胞72h后,细胞培养上清液中NO含量分别为36.36±1.4、33.23±1.5、29.55±2.2、21.59±3.0μmol/l。缺氧条件培养下,50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l 1400W处理细胞24h后,细胞培养上清液中NO含量分别为28.77±2.1、21.63±3.0、17.23±2.4μmol/l,与对照组相比,NO含量明显降低（P<0.01）,呈剂量-效应依赖关系。4. RT-PCR检测结果显示:（1）体外常规培养条件下,对照组、50μM组、100μM组、200μM组处理细胞48h后, iNOSmRNA表达量分别为0.217±0.038、0.170±0.030、0.145±0.030、0.085±0.031;VEGFmRNA表达量分别为0.446±0.016、0.341±0.022、0.261±0.034、0.190±0.036。各组浓度的1400W均能抑制iNOSmRNA表达（P<0.05）、VEGFmRNA表达（P<0.05）。（2）体外缺氧培养条件下,对照组、50μM组、100μM组、200μM组处理细胞24h后, iNOSmRNA表达量分别为0.246±0.009、0.212±0.009、0.169±0.012、0.136±0.006;VEGFmRNA表达量分别为0.598±0.040、0.429±0.038、0.309±0.022、0.249±0.014。各组浓度的1400W均能抑制iNOSmRNA表达（P<0.05）、VEGFmRNA表达（P<0.05）。结论选择性iNOS抑制剂1400W可抑制体外人肝癌细胞株7721体外增殖,促进细胞的凋亡,机制可能与其阻止细胞周期进展和抑制VEGF表达有关。提示1400W对肝癌生长和转移可能有抑制作用。为筛选选择性iNOS抑制剂类似物临床靶向治疗原发性肝细胞肝癌提供了初步的实验依据。
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