论文摘要
目的:建立电刺激大脑皮层点燃的耐苯妥英钠大鼠惊厥模型,研究全蝎乙醇提取物（Scorpion alcohol extraction,SAE）对该耐药模型的对抗作用。观察SAE对耐药惊厥大鼠脑内电刺激损伤区多药耐药基因mdr1 mRNA及其产物P糖蛋白（P-glucoprotein,Pgp）表达的影响,从基因和蛋白水平探讨全蝎乙醇提取物抗耐药的作用机制。同时了解苯妥英钠和长期惊厥发作两因素与耐药大鼠脑内多药耐药基因mdr1 mRNA及Pgp表达的关系。方法:采用大鼠大脑皮层运动区定位放置微电极并以强度15s内从0增大至1000μA的单相斜坡梯形双极脉冲反复电刺激此区域点燃的方法,建立大鼠惊厥模型。灌胃惊厥大鼠苯妥英钠（PHT,0.154g·kg-1·d）7天,并于每次给药后用上述相同参数电刺激皮层,建立耐苯妥英钠大鼠惊厥模型。实验共设6组,分别为正常对照组、惊厥模型对照组、耐苯妥英钠惊厥模型对照组、维拉帕米（0.0385g·kg-1）阳性对照组和大、小两种剂量全蝎乙醇提取物（6.5g·kg-1,13.0g·kg-1）组;给药后观察全蝎乙醇提取物对耐药惊厥大鼠惊厥阈值和脑电变化的影响。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术,检测脑内mdr1 mRNA的表达变化;计算各样本mdr1基因扩增条带的灰度值（IOD）与内参基因gapdh扩增条带的IOD值的比值,作为各组大鼠脑内mdr1 mRNA的表达量。采用免疫组化（SABC法）技术,检测脑内Pgp的表达变化;光镜下各脑组织切片随机取6个视野并计数每个视野中表达Pgp的阳性细胞数,取6个视野平均数作为该切片Pgp的表达量。统计分析全蝎乙醇提取物对耐药惊厥大鼠脑内mdr1 mRNA和Pgp表达量的影响,探索全蝎乙醇提取物的抗耐药机制。结果:（1）惊厥模型制备:42只大鼠,除正常对照鼠6只,术后死亡2只,实验过程中电极脱落4只被弃除外,其余30鼠电刺激大脑皮层后,均产生Ⅰ-Ⅴ级发作,EEG出现明显的尖波、棘波或尖（棘）慢综合波。电刺激大鼠大脑皮层第一天,惊厥阈值平均为1191.00±181.98μА,随后所有大鼠的惊厥阈值均持续下降,于第14天稳定于513.50±26.16μА水平,惊厥模型建立成功。（2）耐苯妥英钠惊厥模型制备:30只惊厥大鼠除6只作为惊厥模型对照外,其余24只惊厥大鼠灌胃苯妥英钠。首次给药后,所有接受苯妥英钠处理的大鼠的惊厥阈值均较惊厥模型对照组显著升高（P<0.01）。以后每天给药并电刺激,所有大鼠的惊厥阈值均逐日下降,于药后第7天基本稳定于480.38±18.48μА水平,分别与给PHT前惊厥阈值（515.34±23.511μА）和惊厥模型对照组惊厥阈值（478.17±15.16μА）相比,均无统计学差异（P皆>0.05）,提示耐苯妥英钠惊厥模型制备成功。（3）全蝎乙醇提取物的抗耐药性惊厥作用:灌胃大、小两种剂量全蝎乙醇提取物及维拉帕米,均可使大鼠惊厥阈值明显升高,给药前后组内比较均有统计学差异（P<0.05）。对各组大鼠用药后的惊厥阈值进行组间比较结果表明,惊厥模型组与耐苯妥英钠惊厥模型组惊厥阈值无统计学差异;三个用药组的惊厥阈值均高于惊厥模型组和耐苯妥英钠惊厥模型组,有统计学差异（P分别<0.05）,同时痫性放电较药前减轻。惊厥阈值从高至低依次为:全蝎乙醇提取物大剂量组>维拉帕米组>全蝎乙醇提取物小剂量组,但三组间相互比较均无统计学差异。（4）RT-PCR测定结果:电刺激大鼠大脑皮层后,模型对照组mdr1 mRNA表达量较正常对照组增加,但统计学无差异（P>0.05）;给予苯妥英钠后,耐药模型组mdr1 mRNA表达量较惊厥模型组继续增高,且统计学上具有显著性差异（P<0.01）;分别灌胃全蝎乙醇提取物大、小剂量以及维拉帕米,均可减少mdr1 mRNA表达量,与耐药模型组相比均有显著性统计学差异（P分别<0.01）;维拉帕米组mdr1 mRNA表达量较全蝎乙醇提取物小剂量组少而较大剂量组多,但各组间相互比较均无统计学差异（P>0.05）。（5）免疫组化测定结果:模型对照组Pgp表达量虽然在数值上比正常对照组增高,但没有统计学差异（P>0.05）;耐苯妥英钠惊厥模型组大鼠的Pgp表达量较惊厥模型组明显增高,有显著性统计学差异（P<0.01）;全蝎乙醇提取物大、小剂量组以及维拉帕米阳性对照组Pgp水平均较耐苯妥英钠模型组降低,统计学上均有显著性差异（P分别<0.01）;但维拉帕米组Pgp表达量分别与全蝎乙醇提取物大、小剂量组比较均无统计学差异（P>0.05）。各组Pgp表达变化趋势与RT-PCR测定的mdr1 mRNA表达变化结果一致。结论:（1）电刺激大鼠大脑皮层运动区14天,大鼠出现恒定的部分发作—继发全身性发作（ⅳⅴ级）和典型的痫性放电。灌胃苯妥英钠7天,惊厥大鼠对苯妥英钠产生耐受,耐苯妥英钠惊厥模型造模成功。该模型作为新型耐药惊厥动物模型用于探讨难治性癫痫的作用机制和抗耐药制剂的筛选研究具有推广使用价值。（2）苯妥英钠可显著诱导mdr1基因mRNA和Pgp的表达,而长期惊厥发作对其表达也有一定的诱导作用。可见电刺激大鼠大脑皮层点燃耐苯妥英钠惊厥模型产生耐药的机制与苯妥英钠和长期惊厥发作两方面因素协同诱导mdr1 mRNA和Pgp表达增加有关。（3）两种剂量全蝎乙醇提取物和维拉帕米灌胃给药,均能使耐苯妥英钠惊厥大鼠的惊厥阈值升高,痫性放电减轻,对该耐药惊厥模型产生对抗作用,且抗耐药惊厥作用性质与维拉帕米相似。提示,全蝎乙醇提取物用于防治难治性癫痫可能有效。（4）两种剂量全蝎乙醇提取物和维拉帕米均可抑制耐药惊厥大鼠脑内mdr1 mRNA表达,同时可明显降低耐药惊厥大鼠脑内耐药蛋白Pgp的含量。说明全蝎乙醇提取物和维拉帕米的抗耐药机制与其抑制耐药惊厥大鼠脑内mdr1 mRNA表达和相应减少其表达产物Pgp有关。由于全蝎乙醇提取物和维拉帕米组大鼠脑内Pgp表达变化趋势与RT-PCR测定的mdr1 mRNA表达变化结果一致,可见全蝎乙醇提取物抑制Pgp表达的直接原因与抑制了Pgp基因mdr1 mRNA的表达有关,从而发挥了抗耐药作用,而且其作用性质与维拉帕米相似。（5）维拉帕米是国际公认的第一代Pgp抑制剂,临床作为添加剂用剂量递增法治疗难治性癫痫部分性发作,疗效确切,安全可靠。全蝎乙醇提取物的作用性质与维拉帕米相似,作为新型Pgp抑制剂有望成为难治性癫痫的有效辅助治疗药物。
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