链霉菌LZ35菌株中沉默新安莎基因簇的激活和hygrocin生物合成研究

论文摘要

耐药病原微生物和各种新型传染病的不断出现,迫使人们不断寻求新的药物。天然产物一直是新药发现的源泉,其中放线菌尤其是链霉菌产生的次级代谢产物是抗生素和其它药物的主要来源。基因组测序数据显示微生物中含有大量的次级代谢基因簇,其编码次级代谢产物的合成潜力远超过已发现代谢产物的数量,其中大部分次级代谢基因簇是沉默或低表达的,基因组挖掘的方法是发现这些基因簇代谢产物的有力工具。安莎霉素是一类主要由放线菌产生的结构独特的大环内酰胺类抗生素,具有显著的生物活性,如抗菌、抗肿瘤和酶抑制剂等。在后基因组时代,通过基因组挖掘发现微生物中新颖安莎代谢产物,为新药研究提供先导化合物,对新药创制具有重要意义。本学位论文研究通过全基因组测序和生物信息学分析,从链霉菌LZ35菌株中发现3个安莎基因簇,包括安莎化合物geldanamycin生物合成基因簇（gdm）和hygrocin生物合成基因簇（hgc）,以及一个结构未知的新安莎基因簇（nam）。分析nam生物合成基因簇,其可能编码一个新型8酮萘安莎化合物。在实验室条件下,优化发酵条件未能分离得到这一安莎化合物,推测nam基因簇是沉默的或其表达量低于检测限。我们采用了3条途径尝试激活这个沉默安莎基因簇表达：（1）在聚酮合酶基因前插入组成型表达ermEp*启动子,RT-PCR分析显示部分激活了基因簇表达,分离得到一个中间体4酮化合物。（2）分别敲除nam基因簇中TetR家族负调控因子,HPLC分析突变株发酵产物,与野生型相比未发现明显的代谢谱变化。（3）通过组成型过表达基因簇中LuxR家族调控因子Naml,全面激活了nam基因簇的表达,得到基因簇的编码产物neoansamycins。生物活性测定显示neoansamycin A对HeLa和HepG-2细胞的ICso均为10μM,具有中等的抗肿瘤活性。Neoansamycins生物合成中含有乙基丙二酰辅酶A和戊基丙二酰辅酶A两种不常见的延伸单元,阻断nam8基因终止了neoansamycins的产生,表明nam8基因可能与戊基丙二酰辅酶A的合成相关。基因nam7与rifemycin生物合成基因簇中rif-orf19同源,可能参与萘环的形成,阻断nam7基因终止了neoansamycins的产生,积累了一个可能是苯安莎的中间代谢产物。Hygrocins是LZ35菌株产生的另一类萘安莎化合物,其生物合成机制尚未见报道。我们通过序列分析在基因组上定位了其生物合成基因簇,通过阻断hgcA基因进行了确认。对hgc基因簇开展了以下几方面的工作：（1）前体AHBA及乙基延伸单元的合成。表明hygrocin生物合成和其它次级代谢产物途径存在前体共享性,与geldanamycin生物合成途径共用起始单元AHBA,与其它生物合成途径共用延伸单元乙基丙二酰辅酶A。（2）酰胺合酶的功能验证。酰胺合酶是安莎类化合物特有的聚酮链释放和环化酶,在hgcF基因敲除突变株中分别回补其它安莎基因簇来源的酰胺合酶基因,结果ansalactam和divergolides基因簇的酰胺合酶可以环化hygrocin生物合成聚酮链,并产生新的hygrocin衍生物。（3）氧化后修饰基因功能的研究。通过对hgc基因簇中7个氧化还原酶基因敲除,确定了hgc2、hgc3和hgc4与hygrocin的生物合成相关。基因rif-orf19交叉回补实验,表明羟基化酶Hgc2可能参与hygrocin萘环形成；单氧化酶Hgc3可能通过Baeyer-Villiger氧化反应催化hygrocin C5/C6位的氧化断裂；P450氧化酶Hgc4负责催化hygrocin C7位的羟基化反应。（4） hygrocin生物合成调控的研究。通过基因敲除、回补及组成型过表达LAL家族调控基因hgcl,证明Hgc1是hygrocin生物合成途径的正调控因子。综上,本学位论文研究通过基因组挖掘策略,从链霉菌LZ35菌株中发现了一类新骨架的安莎类化合物neoansamycins,一方面证明了由基因序列指导天然产物发现研究策略的可行性和有效性；另一方面证实了自然界微生物中还存在许多新骨架安莎的猜想。对hygrocins的生物合成研究,加深了我们对安莎生物合成机制的理解,为进一步通过组合生物学和合成生物学手段,理性改造获得更优良的安莎类先导化合物提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写说明
• 第一章 前言
• 1 微生物来源天然产物研究现状
• 2 微生物来源天然产物发掘方法
• 2.1 挖掘特殊生境微生物资源
• 2.1.1 海洋微生物
• 2.1.2 植物内生菌
• 2.1.3 未培养微生物
• 2.1.4 被忽视的微生物
• 2.2 改进微生物培养方法
• 2.2.1 营养条件调控
• 2.2.2 微生物共培养
• 2.2.3 N-乙酰氨基葡萄糖系统
• 2.2.4 诱导小分子
• 2.3 基因组挖掘
• 2.3.1 过表达正调控因子
• 2.3.2 敲除负调控因子
• 2.3.3 置换启动子
• 2.4 异源表达
• 2.4.1 宏基因组
• 2.4.2 沉默基因簇
• 2.5 工程技术
• 2.5.1 代谢工程
• 2.5.2 核糖体工程
• 2.5.3 组合生物合成
• 2.6 合成生物学
• 3 安莎霉素类抗生素简介
• 4 本学位论文研究背景,内容及意义
• 第二章 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 质粒
• 1.3 培养基
• 1.4 化学试剂
• 1.5 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 菌株培养及保藏
• 2.2 大肠杆菌质粒DNA提取
• 2.3 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2.4 PCR扩增基因片段
• 2.5 PCR产物纯化
• 2.6 DNA片段回收
• 2.7 质粒和DNA片段酶切
• 2.8 质粒酶切产物去磷酸化
• 2.9 目的片段与载体连接
• 2.10 质粒DNA转化大肠杆菌
• 2.11 蛋白异源表达与纯化
• 2.12 蛋白晶体获得
• 2.13 基因定点突变
• 2.14 基因转录分析
• 2.15 静息细胞培养
• 2.16 生物活性测定
• 2.17 链霉菌基因组DNA提取
• 2.18 基因组fosmid文库构建
• 2.19 文库的筛选
• 2.20 目的基因敲除
• 2.21 接合转移
• 2.22 菌株发酵检测
• 2.23 生物信息学分析
• 第三章 结果与分析
• 第一节 Streptomyces sp.LZ35中安莎生物合成基因簇分析
• 1.1 LZ35菌株全基因组测序
• 1.2 LZ35菌株中安莎基因簇的定位及序列分析
• 1.2.1 Hygrocin生物合成基因簇序列分析
• 1.2.2 Geldanamycin生物合成基因簇序列分析
• 1.2.3 沉默新安莎生物合成基因簇序列分析
• 1.3 小结与讨论
• 第二节 Streptomyces sp.LZ35菌株中沉默新安莎基因簇特征分析
• 2.1 沉默新安莎基因簇生物信息学分析
• 2.1.1 起始单元AHBA生物合成基因
• 2.1.2 聚酮合酶基因
• 2.1.3 奈环形成基因
• 2.1.4 延伸单元合成基因
• 2.1.5 酰胺合酶基因
• 2.1.6 基因簇中调控因子
• 2.2 沉默新安莎基因簇代谢产物结构预测
• 2.3 小结与讨论
• 第三节 Streptomyces sp.LZ35菌株的遗传改造
• 3.1 LZ35菌株遗传操作体系的建立
• 3.1.1 生长培养基选择
• 3.1.2 抗生素敏感实验
• 3.1.3 接合转移条件优化
• 3.1.4 基因阻断流程建立
• 3.2 LZ35菌株中部分次级代谢生物合成基因簇阻断
• 3.2.1 LZ35ΔgdmAI突变株构建
• 3.2.2 LZ35ΔgdmAIΔnigA突变株构建
• 3.2.3 LZ35ΔgdmAIΔnigA△elpA突变株构建
• 3.2.4 LZ35△gdmAIΔnigA△elpAΔhgcA突变株构建
• 3.3 小结与讨论
• 第四节 Streptomyces sp.LZ35菌株中沉默新安莎基因簇的激活
• 4.1 大规模发酵未能获得沉默新安莎基因簇的代谢产物
• *置换PKS基因启动子'>4.2 红霉素抗性基因启动子ermEp^*置换PKS基因启动子
• 4.2.1 启动子置换突变株构建
• 4.2.2 启动子置换突变株代谢产物分析
• 4.2.3 启动子置换突变株转录分析
• 4.3 敲除nam基因簇中途径专一性负调控基因
• 4.3.1 TetR敲除突变株的构建
• 4.3.2 TetR敲除突变株代谢产物分析
• 4.4 过表达nam基因簇中途径专一性正调控基因
• 4.4.1 过表达Nam1基因的突变株构建与分析
• 4.4.2 沉默安莎基因簇的验证
• 4.4.3 未知安莎化合物产量提高
• 4.4.4 过表达Nam1突变株转录分析
• 4.5 沉默安莎基因簇代谢产物分离及结构鉴定
• 4.6 Neoansamycin的生物活性
• 4.7 小结与讨论
• 第五节 Neoansamycin的生物合成研究
• 5.1 敲除ccr基因突变株的构建及分析
• 5.2 Nam8蛋白表达及纯化
• 5.3 Nam8蛋白结晶
• 5.4 Neoansamycin基因簇中其他基因功能验证
• 5.4.1 基因阻断突变株构建
• 5.4.2 突变株代谢产物HPLC分析
• 5.5 Neoansamycin生物合成途径推测
• 5.6 小结与讨论
• 第六节 Hygrocin的生物合成研究
• 6.1 Hygrocin生物合成基因簇的确证
• 6.1.1 Hygrocin聚酮合酶基因分析
• 6.1.2 敲除hgcA基因突变株的构建与分析
• 6.2 Hygrocin中AHBA起始单元合成
• 6.2.1 LZ35菌株中AHBA生物合成基因分析
• 6.2.2 敲除AHBA合酶基因突变株的构建与分析
• 6.3 Hygrocin的释放与环化
• 6.3.1 酰胺合酶基因分析
• 6.3.2 敲除hgcF基因突变株的构建
• 6.3.3 酰胺合酶基因回补菌株的构建
• 6.3.4 酰胺合酶基因回补菌株代谢产物HPLC分析
• 6.3.5 回补菌株SR307ALT代谢产物分离鉴定
• 6.4 Hygrocin中乙基丙二酰辅酶A单元的合成
• 6.5 Hygrocin生物合成调控
• 6.5.1 调控基因突变株构建与分析
• 6.5.2 Hgc1正调控hygrocin的生物合成
• 6.6 Hygrocin氧化后修饰基因
• 6.7 Hgc2参与hygrocin奈环形成
• 6.7.1 基因hgc2对突变株SR315回补
• 6.7.2 基因rif-orfl9对突变株SR315回补
• 6.8 Hgc3参与hygrocin C5/C6位氧插入
• 6.8.1 基因hgc3对突变株SR316回补
• 6.8.2 突变株SR316代谢产物DM12的分离
• 6.9 Hgc4参与hygrocin C7位羟基化
• 6.9.1 基因hgc4对突变株SR317回补
• 6.9.2 突变株SR317代谢产物的分离
• 6.9.3 Hgc4蛋白表达及纯化
• 6.9.4 Hgc4体外催化活性
• 6.10 Hygrocin结构理性改造
• 6.10.1 HgcE中DH基因敲除突变株构建
• 6.10.2 HgcE中DH基因点突变
• 6.10.3 点突变菌株SR321代谢产物HPLC分析
• 6.11 Hyrocin生物合成途径推测
• 6.12 小结与讨论
• 第四章 总结与展望
• 1 本研究工作总结
• 2 本研究工作展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 博士期间发表的学术论文