裂褶多糖的制备与理化特性及化学改性研究

论文摘要

裂褶多糖（Schizophyllan）是一种生物反应调节剂,它在临床应用上表现出良好的抗肿瘤活性。此外,裂褶多糖独特的理化性质还展示其在食品、保健品、药物载体、化妆品等领域应用的前景。而目前对于其应用方面的基础研究及化学改性研究不多,制约了裂褶多糖的应用。本论文对裂褶菌的培养、裂褶多糖的制备方法以及应用方面的理化特性等展开系统的研究,对裂褶多糖的化学改性及构效关系进行探讨,将为促进裂褶多糖的开发,并为提升多糖产品的应用价值提供理论基础。主要研究内容和结果如下:1.裂褶菌的形态变化和产多糖规律通过外部形态观察和显微观察对裂褶菌不同培养条件下菌丝形态变化进行研究,结合对裂褶多糖、还原糖等发酵参数的测定,发现裂褶菌胞外多糖的合成呈半生长偶联型,且多糖的产量和菌体形态有关,通过控制溶氧或搅拌使发酵时菌丝形成较多“有效生长点”,可以在较低的生物量下提高胞外裂褶多糖的产量。2.克量级裂褶多糖的快速纯化及其结构鉴定裂褶菌发酵液经离心除菌体,活性炭脱色,Sevag法脱蛋白,乙醇沉淀,透析,50kD膜包浓缩和冷冻干燥,可得到均一的裂褶菌胞外多糖,该方法适合于对克量级的裂褶多糖进行纯化。采用UV、IR、HPLC、GC-MS、1H NMR和13C NMR对Sc1菌株分泌的裂褶多糖的结构进行鉴定,确证其结构为β-（1→3）主链上每隔3个葡萄糖单元产生一个β-（1→6）分支,GPC法测得其重均分子量和数均分子量分别为2.5×107和1.2×107,为进一步的应用提供基础数据。3.裂褶多糖的理化特性采用乌式粘度计、旋转粘度计、GPC对裂褶多糖分子量的测定方法,以及粘度和构象之间的关系展开研究,通过文献数据,完善粘度法测定裂褶多糖分子量的公式。通过控制干燥器内湿度的方法测试裂褶多糖的吸湿和保湿性能,采用DSC测定裂褶多糖的热力学参数。结果表明裂褶多糖具有良好的吸湿和保湿性能,是一种有很大开发潜力的天然保湿剂。采用多功能微板,以超纯水为空白,激发波长390nm,发射波长520nm,发现在2.6×10-6～6.5×10-4g/L的裂褶多糖浓度范围内,ANSA荧光强度和裂褶多糖的含量呈线性相关。对于两种不同纯度的裂褶多糖样品,采用350nm非特征吸收波长检测和硫酸-苯酚法490nm特征吸收检测对多糖分离的结果一致,表明350nm可作为监测不同纯度裂褶多糖洗脱以及分离条件优化的波长。基于实验室的研究路线提出两条可行的纯化kg级液体制剂或固体粉剂裂褶多糖的工艺路线,为放大生产提供依据。4.裂褶多糖的乙酰化和羧甲基化改性合成不同取代度的乙酰裂褶多糖和羧甲基裂褶多糖,采用UV、IR、1H NMR或13C NMR等方法对改性裂褶多糖的结构进行表征。讨论了影响羧甲基裂褶多糖取代度的各种因素,建立了红外光谱测定其取代度的方法。乙酰裂褶多糖在水中难以溶解,而经羧甲基化改性可得易于溶解的羧甲基裂褶多糖。5.羧甲基化裂褶多糖的抗肿瘤活性裂褶多糖和3种不同取代度的羧甲基裂褶多糖在3.3,16.7,33.3μg/mL的浓度范围内,在体外细胞试验中没有表现出对GLC-82肿瘤细胞的抑制作用。在小鼠体内试验中,取代度为0.67和0.93的羧甲基裂褶多糖,以10mg/kg的剂量连续腹腔给药10d,对荷H22肝癌小鼠的抑瘤效果显著,抑瘤率分别为41.3%和37.9%。而取代度为1.14的羧甲基裂褶多糖则未表现出抑瘤活性,表明羧甲基裂褶多糖的抗肿瘤活性和取代度有关。对肿瘤的组织学观察表明:取代度为0.67的羧甲基裂褶多糖可以引起小鼠体内H22肿瘤细胞的死亡或凋亡,并出现淋巴细胞浸润肿瘤。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 蕈菌多糖研究进展
• 1.1.1 蕈菌和蕈菌多糖概述
• 1.1.2 蕈菌的培养
• 1.1.3 蕈菌多糖的提取与纯化
• 1.1.4 蕈菌多糖的结构
• 1.1.5 蕈菌多糖的理化性质
• 1.1.6 蕈菌多糖的生物活性
• 1.1.7 蕈菌多糖的分子修饰与构效关系
• 1.2 裂褶多糖的研究进展
• 1.2.1 裂褶多糖的理化性质
• 1.2.2 裂褶菌的深层发酵
• 1.2.3 裂褶多糖的改性及生物活性
• 1.2.4 相关专利
• 1.3 本研究的立题背景、研究意义和主要研究内容
• 第二章 裂褶菌培养与裂褶多糖结构表征
• 2.1 裂褶菌形态变化和多糖积累
• 2.1.1 材料与仪器
• 2.1.2 培养条件
• 2.1.3 生物量测定
• 2.1.4 发酵液中多糖含量测定
• 2.1.5 发酵液中还原糖含量测定
• 2.1.6 pH 值测定
• 2.1.7 显微拍照
• 2.1.8 菌球直径测量
• 2.1.9 结果与讨论
• 2.2 裂褶多糖分离纯化和结构表征
• 2.2.1 材料与仪器
• 2.2.2 裂褶多糖的分离纯化
• 2.2.3 纯度鉴定
• 2.2.4 元素分析
• 2.2.5 凝胶渗透色谱测定分子量
• 2.2.6 结构分析
• 2.2.7 扫描电镜观察
• 2.2.8 结果与讨论
• 2.3 本章小结
• 第三章 裂褶多糖的理化特性
• 3.1 粘度法测定裂褶多糖分子量
• 3.1.1 材料与仪器
• 3.1.2 硫酸-苯酚法测定多糖含量
• 3.1.3 特性粘数和分子量的测定
• 3.1.4 结果与讨论
• 3.2 裂褶多糖的粘度及构象分析
• 3.2.1 材料与仪器
• 3.2.2 相对粘度和表观粘度的测定
• 3.2.3 刚果红实验
• 3.2.4 结果与讨论
• 3.3 裂褶多糖的吸湿和保湿特性
• 3.3.1 材料与仪器
• 3.3.2 吸湿试验
• 3.3.3 保湿试验
• 3.3.4 精密度和准确度
• 3.3.5 差示扫描量热测试
• 3.3.6 结果与讨论
• 3.4 裂褶多糖和荧光试剂的相互作用
• 3.4.1 材料与仪器
• 3.4.2 激发光谱和发射光谱测试
• 3.4.3 激发波长和发射波长选择
• 3.4.4 溶剂极性对荧光强度的影响
• 3.4.5 pH 对荧光强度的影响
• 3.4.6 多糖和荧光试剂的作用
• 3.4.7 结果与讨论
• 3.5 裂褶多糖检测方法的改进
• 3.5.1 材料与仪器
• 3.5.2 常压凝胶柱层析
• 3.5.3 高效液相色谱
• 3.5.4 蛋白质含量测定
• 3.5.5 结果与讨论
• 3.6 Kg 量级裂褶多糖的纯化方案
• 3.7 本章小结
• 第四章 裂褶多糖的化学改性
• 4.1 裂褶多糖的乙酰化及其光谱表征
• 4.1.1 材料与仪器
• 4.1.2 乙酰化
• 4.1.3 溶解性的测试
• 4.1.4 红外光谱分析
• 4.1.5 紫外光谱分析
• 1H NMR'>4.1.6¹H NMR
• 4.1.7 分子量测定
• 4.1.8 取代度分析
• 4.1.9 结果与讨论
• 4.2 裂褶多糖的羧甲基化及其光谱表征
• 4.2.1 材料与仪器
• 4.2.2 羧甲基化
• 4.2.3 溶解性的测试
• 4.2.4 原子吸收光谱和红外光谱测定取代度
• 4.2.5 紫外光谱分析
• 4.2.6 分子量测定
• 13C NMR'>4.2.7¹³C NMR
• 4.2.8 结果与讨论
• 4.3 本章小结
• 第五章 羧甲基裂褶多糖的抗肿瘤活性
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 仪器与设备
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 体外抗肿瘤活性试验
• 5.2.2 体内抗肿瘤活性试验
• 5.2.3 H22 肿瘤切片
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 体外抗肿瘤活性
• 5.3.2 体内抗肿瘤活性
• 5.3.3 H22 肿瘤的组织学观察
• 5.4 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 在学期间发表与学位论文相关的学术论文
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢