拟南芥中性蔗糖酶基因AtNIN1（neutral invertase）的功能及其在侧根发育中的调控机制研究

论文摘要

蔗糖的分解对植物的生长发育起着重要的作用，不仅调控着体内碳源的分配，而且提供己糖依赖的糖信号的起始。蔗糖的分解主要有蔗糖酶或蔗糖合成酶参与的两条路径，植物中蔗糖酶包括酸性蔗糖酶和中性／碱性蔗糖酶。大量的研究表明酸性蔗糖酶在植物伤害的防御、细胞分化、果实的发育等过程中发挥重要的功能。但对中／碱性蔗糖酶的研究甚少，中／碱性蔗糖酶在植物发育中的功能仍然未知。 渗透胁迫通过抑制侧根顶端分生组织的激活从而抑制侧根的发育。已知ABA在这个抑制过程中发挥了重要作用，但具体的分子机制仍不清楚。我们筛选到一个渗透胁迫抑制侧根发育不敏感的突变体，经基因克隆得知该突变体是由于一个中性蔗糖酶基因突变导致而成，命名为Atninl。经过对Atninl突变体和AtNINl基因的研究我们得出以下结论： 1．AtNINl基因突变导致了拟南芥主根的缩短，降低了高渗对侧根抑制的敏感 性。CycB1-GUS转基因材料的结果显示渗透胁迫条件下，Atninl突变体在侧根原基和侧根分生区的细胞分裂活性要高于野生型。 2．AtNINl基因还调控植物地上部的发育包括花序的提前抽出，叶片、果荚变小，植物矮小等。 3．图位克隆的结果显示Atninl突变体是由于中性蔗糖酶基因AtNINl突变导致而成，回复结果也充分证明了这一结论。 4．AtNINl特异性地催化蔗糖分解为葡萄糖和果糖，这不同于酸性蔗糖酶，后者大都是β—果糖苷酶类，二者在蛋白序列上也无同源性。中性蔗糖酶是植物和光合细菌所特有的一类基因。 5．渗透胁迫可以诱导体内中性蔗糖酶活性的增加，Atninl突变体内的中性蔗糖酶活性在正常和渗透处理条件下都低于野生型。糖含量测定的结果显示不论在对照和甘露醇处理条件下，Atninl体内己糖对蔗糖的比例都要远远小于野生型的比例。 6．Atninl对葡萄糖、ABA抑制侧根的敏感性要高于野生型，外源低浓度的葡萄糖或ABA就能回复渗透胁迫对Atninl侧根发育的抑制。这说明葡萄糖和ABA信号传导的路径在Atninl突变体内并没有中断，而是由于突变体内葡

论文目录

• 致谢
• 缩略表
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 蔗糖酶的研究进展
• 1.1. Invertase介绍
• 1.2. Invertase研究近况
• 2. 侧根的发生发育机理及环境调控
• 2.1 侧根发育过程
• 2.2 侧根发生发育调控基因
• 2.3 激素信号调控侧根发生发育
• 2.3.1 生长素调控机制
• 2.3.2 细胞分裂素调控机制
• 2.3.3 脱落酸调控机制
• 2.4 环境因素调控侧根发生发育
• 3. 渗透胁迫、糖信号与 ABA
• 3.1 糖信号与 ABA
• 3.2 渗透胁迫与 ABA
• 3.3 渗透信号与糖信号
• 4. 立题依据
• 第二章 突变体的筛选及表型分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 拟南芥生长条件
• 1.2.2 表型处理试验
• 1.2.3 GUS染色及显微观察
• 1.2.4 培养基及试剂配方
• 2. 结果
• 2.1 突变体筛选及渗透胁迫处理
• 2.2 甘露醇对Atninl和野生型根系发育的影响
• 2.3 CycB1-GUS表达模式
• 2.4 突变体与野生型地上部表型分析
• 3. 小结
• 第三章 基因克隆及基因表达分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1. F2群体的构建及遗传分析
• 1.2.2. F2群体DNA提取
• 1.2.3 图位克隆的方法
• 1.2.4 精细定位的分子标记
• 1.2.5 RNA提取及RT-PCR
• 1.2.6 基因克隆与测序分析
• 1.2.7 回复载体构建
• 1.2.8 启动子融合GUS载体构建
• 1.2.9 拟南芥转基因
• 1.2.10 GUS染色及显微观察
• 2. 结果
• 2.1 遗传分析
• 2.2 基因定位
• 2.3 候选基因测序
• 2.4 回复验证
• 2.5 AtNIN1基因表达模式
• 3. 小结
• 第四章 蛋白结构及进化分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 基因家族的进化分析
• 1.2.2 亚家族的同源性分析
• 2. 结果
• 2.1 进化树分析
• 2.2 结构域同源性分析
• 3. 小结
• 第五章 蛋白酶活测定及特性分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 载体构建过程
• 1.2.2 蛋白原核表达
• 1.2.3 总蛋白测定
• 1.2.4 酶活测定
• 1.2.5 糖含量测定
• 2. 结果
• 2.1 AtNIN1基因原核表达
• 2.2 酶活测定
• 2.3 底物特异性测定
• 2.4 野生型与突变体拟南芥中的中性蔗糖酶活性以及体内糖组分的比较
• 3. 小结
• 第六章 高渗，葡萄糖，脱落酸对Atnin1侧根发育的影响
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 甘露醇、葡萄糖、ABA处理
• 1.2.2 RT-PCR
• 2. 结果
• 2.1 葡萄糖和ABA对侧根发育的影响
• 2.2 葡萄糖、ABA回复高渗胁迫对Atnin1突变体侧根发育的抑制
• 3. 小结
• 讨论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的科研论文