雌激素受体α对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用

论文摘要

背景多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种是以中枢神经系统（Central nervous system, CNS）血管周围炎性细胞浸润为主,可伴有多灶性白质脱髓鞘为病变特征的自身免疫性疾病,目前尚无有效的治疗方法。临床研究的数据表明雌激素可以改善复发-缓解型MS患者的部分生化和临床指标,这提示雌激素或许可以用于治疗MS。雌激素的生理作用由α和β两种亚型的雌激素受体（Estrogen receptor,Er）介导,Er是雌激素产生生物学效应的必要因素。研究发现雌激素抑制EAE炎症反应可能是通过Erα发挥效应,因此脑组织中有关Erα的研究成为人们关注的焦点。目的构建携带C57BL/6小鼠Erα的重组慢病毒。用实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）作为MS的动物模型,将Erα重组慢病毒立体定位注射EAE小鼠侧脑室,拟用Erα过表达的方法初步探讨雌激素和Erα在EAE中的抗炎作用及其作用机制,观察Erα重组慢病毒的疗效。方法使用逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）方法从C57BL/6小鼠卵巢细胞中扩增Erα编码序列（Coding sequence, CDS）区基因片段,至pMD19-T载体后测序鉴定。将Erα基因片段插人慢病毒主体载体LV-GFP-flag,构建重组慢病毒载体LV-Erα-flag。通过琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis, AGE）,基因测序验证后,将LV-Erα-flag与包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染293T细胞,测定病毒滴度,获得携带Erα的重组慢病毒V-Erα-flag。将V-Erα-flag感染293T细胞,western blot方法检测Erα蛋白表达。无血清原代培养小鼠神经细胞,小鼠神经元特异性烯醇化酶（Neuron specific enolase, NSE）免疫组化染色方法鉴定神经元的纯度。用对照病毒V-GFP-flag感染神经细胞,在荧光显微镜下每天观察荧光表达情况,流式细胞仪（Flow cytometry, FCM）检测细胞感染率及凋亡率用于判断最佳MOI。用最佳MOI的重组慢病毒V-Erα-flag感染神经细胞,实时定量PCR和western blot分别检测V-Erα-flag感染的神经细胞中ErαmRNA和蛋白的表达水平。在小鼠侧脑室立体定位注射V-Erα-flag,H&E及flag免疫荧光组织化学染色鉴定V-Erα-flag在体感染C57BL/6 CNS的最佳剂量。100只C57BL/6小鼠行去卵巢术,术后两周用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（Myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG）35～55多肽诱发EAE模型,病理和影像学方法鉴定该模型。实验分为5组:①雌激素组（雌二醇治疗）,②Erα激动剂组（雷洛昔芬治疗）,③Erα重组慢病毒组（简称Erα组）（Erα重组慢病毒治疗）,④空病毒组,⑤生理盐水（Normal saline, NS）组。比较各组小鼠的临床症状及体重的变化。取脑和脊髓,行H&E染色观察炎症反应,western blot检测髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein,MBP）表达量和勒克斯坚牢蓝（Luxol fast blue, LFB）-H&E染色分析脱髓鞘情况,免疫荧光组织化学染色检测各组EAE小鼠CNS中基质金属蛋白酶9（Matrix metallopeptidase 9, MMP-9）的表达,实时定量PCR及酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA）检测炎性因子MMP-9、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα, TNF-α）、干扰素γ（Interferonγ, IFN-γ）、白细胞介素（Interleukin, IL）-23、IL-17和抑炎因子IL-4的表达。结果测序证实扩增的ErαCDS区基因序列完全正确。AGE及测序鉴定均表明重组慢病毒载体构建成功,包装、扩增后得到Erα重组慢病毒V-Erα-flag,感染滴度为2×108 （TU/ml）。Western blot检测V-Erα-flag感染的293T细胞能表达Erα蛋白,而未受感染的293T细胞不表达Erα蛋白。成功原代培养神经细胞,经NSE免疫组化染色方法鉴定神经元纯度达90%以上。MOI=5的对照病毒V-GFP-flag能感染神经细胞,感染效率达89.8±4.03%而凋亡率仅为3.6±0.29%,神经细胞至少能存活8周,在此期间绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）能持续表达。用MOI=5的V-Erα-flag感染神经细胞后,能显著增强神经细胞中的ErαmRNA和蛋白表达水平。侧脑室立体定位注射15μl V-Erα-flag能成功感染C57BL/6小鼠CNS。经病理和影像学方法鉴定EAE模型构建成功。雌二醇、雷洛昔芬及Erα重组慢病毒治疗与空病毒组,NS组相比,可以降低EAE小鼠的发病率,减轻其临床症状和体重丢失,缓解脑和脊髓中炎性细胞浸润和神经纤维的髓鞘脱失。除此以外,还能够使MMP-9、TNF-α、IFN-γ、IL-23、IL-17的表达降低（P <0.05）,MBP和IL-4的表达升高（P <0.05）,雌激素组、Erα激动剂组及Erα重组慢病毒组相比没有显著性差异（P >0.05）。结论成功构建携带Erα基因的重组慢病毒,感染293T细胞能表达Erα蛋白。MOI=5的V-Erα-flag能有效而稳定感染神经细胞,并上调ErαmRNA和蛋白表达。立体定位注射15μl V-Erα-flag能成功感染小鼠CNS。Erα重组慢病毒治疗EAE小鼠具有和雌二醇、雷洛昔芬相似的疗效,可以降低其发病率,减轻临床症状和体重丢失,缓解脑和脊髓中炎性细胞浸润和髓鞘脱失,抑制EAE小鼠CNS中炎性因子TNF-α,IFN-γ,MMP-9、IL-23、IL-17的表达,增加抑炎因子IL-4的表达。提示雌二醇、雷洛昔芬及Erα重组慢病毒治疗可能通过降低MMP-9、纠正Th1/Th2细胞因子的失衡、抑制IL-23/IL-17轴等机制,减轻EAE小鼠的炎症反应及髓鞘脱失。为MS的治疗提供新的思路。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 小鼠Erα重组慢病毒的构建及鉴定
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 Erα抑制小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的炎症反应
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附插图
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表文章