hpRNA和pac1基因介导抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究

论文摘要

在以往的抗BYDV转基因小麦研究中,已经使用的策略有CP基因介导的病毒抗性、复制酶基因介导的病毒抗性、运动蛋白基因介导的抗性,虽然这些抗性手段对BYDV具有延迟发病的抗性作用,但一直没有获得能够达到高度抗性水平的抗BYDV转基因小麦植株。同时,这些抗性手段都具有专一性,只对基因来源病毒表现抗性,对其他病毒没有作用,即不具有广谱性。本文从进一步提高对BYDV的特异抗性和病毒广谱抗性两个方面入手进行小麦转基因研究,希望获得高抗BYDV的转基因小麦植株和具有广谱病毒抗性的转基因小麦。 在提高对BYDV抗性的转基因小麦研究方面,利用BYDV-GPV株系的复制酶基因（Pep）片段和外壳蛋白基因（CP）片段构建成可表达复合发夹RNA（hpRNA）——含有由Rep片段双链（CP双链）RNA构成的茎和反义CP（反义复制酶片断）RNA构成的环——的表达框架,将该框架分别连入含有CaMV 35S启动子和Emu启动子的真核表达载体,通过农杆菌介导法（转35S:CP+/Rep-/CP-结构）、基因枪法（转Emu:Rep+/CP-/Rep-结构）和花粉管通道法（分别转Emu:Rep+/CP-/Rep-和Emu:CP+/Rep-/CP-结构）对小麦进行遗传转化,基于该结构表达的hpRNA诱发植物体内针对病毒基因组不同部位的RNA干扰机制而达到特异性高度抗病毒的目的。实验结果表明:①在农杆菌介导法获得的82株G418抗性植株中有75株PCR结果呈阳性;经过第一次病毒抗性试验,有59株未发病或只有轻微症状:Dot blot检测表明59株抗性植株中有46株整合有外源基因;ELISA结果表明整合有外源基因的植株中有37株能够正常表达外源基因;Southernblot结果表明外源基因在小麦体内多以双拷贝形式存在:第二次病毒抗性试验表明,在Dot blot、ELISA呈阳性的37株再生植株中有14株表现低度抗性,有12株表现中度抗性,有10株表现高度抗性,另外1株在实验过程中死亡。②在基因枪法转化中,因未使用标记基因,故应用改进的叶片快速PCR对再生幼苗在生根阶段进行筛选,共移栽成活64株快速PCR阳性植株;经第一次病毒抗性试验有30株表现抗性,Dot blot结果表明其中21株整合有外源基因:经第二次病毒抗性试验,21株Dot blot阳性植株中有5株表现低度抗性,有8株表现中度抗性,有8株表现高度抗性。③通过花粉管通道法获得转Emu:Rep+/CP-/Rep-结构的种子367粒,获得转Emu:CP+/Rep-/CP-结构的种子545粒:对T1代幼苗进行大田抗病性鉴定结果表明,有2株转Emu:CP+/Rep-/CP-结构小麦植株在接毒40天后仍没有明显发病症状。 在提高病毒抗性谱方面,利用克隆自粟酒酵母的pac1基因通过农杆菌介导法转化小麦。该基因是一种RNA双链分解酶。由于大多数植物病毒为RNA病毒,不管其基因组是单链还是双链,在寄主体内复制过程都会有一个双链RNA中间体阶段,如果通过基因工程手段将pac1基因转入植物体,利用其降解病毒dsRNA的活性而阻断病毒复制过程,就有可能达到抗植物病毒病的目的。并且pac1的作用靶位点只针对RNA双链,对RNA的序列无特殊要求,这就扩大了其对病毒抗性谱。本转化试验共获得41株G418抗性植株;经第一次病毒抗性试验获得30株抗性植株:其中27株PCR和Dot blot结果呈阳性:ELISA和RT-PCR结果表明27株整合有外源基因的再生植株中有25株能够正常表达外源基因;经第二次病毒抗性试验,获得12株低度抗性植株,12

论文目录

• 第1章 文献综述
• 1.1 大麦黄矮病毒研究进展
• 1.1.1 生物学特征
• 1.1.1.1 寄主范围和症状
• 1.1.1.2 株系及分布
• 1.1.1.3 病毒传播特点
• 1.1.1.4 病毒颗粒结构
• 1.1.2 分子生物学特征
• 1.1.2.1 基因组结构
• 1.1.2.2 基因产物的功能
• 1.2 抗病毒转基因植物研究进展
• 1.2.1 病毒基因介导的抗病性
• 1.2.1.1 外壳蛋白（Coat protein，CP）基因
• 1.2.1.2 复制酶基因（Replicase gene）
• 1.2.1.3 运动蛋白（Movement Protein，MP）基因
• 1.2.1.4 卫星RNA（Satellite RNA）
• 1.2.1.5 RNA干扰介导的抗性
• 1.2.2 非病毒来源的基因介导的抗性
• 1.2.2.1 植物抗病基因
• 1.2.2.2 核糖体失活蛋白（Ribosome inactivating proteins，RIPs）
• 1.2.2.3 核酶（Ribozyme）
• 1.2.2.4 抗体（Antibodies）
• 1.2.2.5 dsRNA分解酶介导的抗性
• 1.3 RNA干扰与植物抗病毒
• 1.3.1 RNAi过程
• 1.3.1.1 RNAi的起始
• 1.3.1.2 RISC的装配
• 1.3.1.3 RNAi作用特点
• 1.3.2 病毒编码的RNA沉默抑制蛋白
• 1.3.2.1 p19蛋白
• 1.3.2.2 HC-Pro
• 1.3.2.3 C2蛋白
• 1.3.2.4 2b蛋白
• 1.3.2.5 NS蛋白
• 1.3.2.6 其他抑制蛋白
• 1.3.3 RNAi技术在植物抗病毒基因工程中的应用
• 第2章 材料与方法
• 2.1 DNA克隆及测序
• 2.1.1 试剂及仪器
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2.1.4 质粒提取
• 2.1.4.1 质粒的小量制备
• 2.1.4.2 质粒的大量制备
• 2.1.5 质粒纯化
• 2.1.6 酶切、目的片断回收及连接转化
• 2.1.6.1 酶切及目的片断回收
• 2.1.6.2 连接及转化
• 2.1.7 重组质粒的快速筛选
• 2.1.8 序列测定
• 2.2 遗传转化
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 农杆菌介导的转化
• 2.2.2.1 菌株及载体
• 2.2.2.2 农杆菌用培养基
• 2.2.2.2 农杆菌感受态制备及转化
• 2.2.2.3 植物组培用培养基
• 2.2.3 基因枪法介导的转化
• 2.2.3.1 真核表达载体
• 2.2.3.2 轰击操作
• 2.2.4 花粉管通道法介导的转化
• 2.3 再生植株的检测
• 2.3.1 小麦基因组DNA的提取
• 2.3.2 植物组织总RNA提取
• 2.3.3 PCR检测
• 2.3.3.1 直接用叶片进行的PCR快速检测
• 2.3.3.2 以提取的小麦基因组DNA为模板的PCR检测
• 2.3.4 Dot Blot
• 2.3.5 Southern Blot
• 2.3.5.1 探针标记
• 2.3.5.2 膜制备
• 2.3.5.3 杂交
• 2.3.5.4 检测
• 2.3.6 nptII ELISA检测
• 第3章 病毒来源发夹RNA介导抗BYDV转基因小麦研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 真核表达载体的构建
• 3.1.2 用于转化的真核表达载体的制备
• 3.1.3 小麦幼胚组织培养
• 3.1.3.1 小麦品种及组织材料
• 3.1.3.2 幼胚的获取及培养
• 3.1.4 农杆菌介导的遗传转化
• 3.1.4.1 菌液的准备
• 3.1.4.2 浸染转化
• 3.1.4.3 抗性愈伤组织的筛选和转基因苗的获得
• 3.1.5 基因枪法进行的遗传转化
• 3.1.6 花粉管通道法介导的遗传转化
• 3.1.7 转基因再生小麦植株的分子生物学检测
• 3.1.8 抗性检测方法
• 3.1.8.1 温室病毒抗性检测方法
• 3.1.8.2 大田病毒抗性检测方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 农杆菌介导对小麦的遗传转化
• 3.2.1.1 hpRNA真核表达载体构建
• 3.2.1.2 转化及再生植株的获得
• 3.2.1.3 T0代G418抗性植株的分子生物学检测
• 3.2.1.4 再生植株的抗病性检测
• 3.2.2 基因枪法对小麦的遗传转化
• 3.2.2.1 hpRNA真核表达载体构建
• 3.2.2.2 质粒的纯化
• 3.2.2.4 T0代再生植株的分子生物学检测
• 3.2.2.5 再生植株的抗病性检测
• 3.3.3 花粉管通道法对小麦的遗传转化
• 3.3.3.1 hpRNA真核表达载体构建
• 3.3.3.2 转化及转化种子的获得
• 3.3.3.3 T1代植株的抗病性筛选
• 3.4 讨论
• 3.4.1 小麦遗传转化的外植体选择
• 3.4.2 小麦遗传转化方法
• 3.4.3 hpRNA介导的抗性
• 第4章 pac1介导抗BYDV转基因小麦研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 载体
• 4.1.2 农杆菌介导转化
• 4.1.3 T0代再生植株的分子生物学检测
• 4.1.4 病毒抗性检测方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 转基因再生植株的获得
• 4.2.2 转基因再生植株的分子检测
• 4.2.3 转基因再生植株的抗病性鉴定
• 4.3 讨论
• 第5章 正反向双启动子dsRNA双元表达载体构建
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 表达框架构建
• 5.1.2 载体构建
• 5.1.3 功能检测体系
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 表达框架的序列测定
• 5.2.1 农杆菌瞬时转染转gfp烟草
• 5.3 讨论
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.1.1 获得多株对BYDV表现不同程度抗性的转复合hpRNA小麦再生植株
• 6.1.2 获得多株对BYDV表现不同程度抗性的转pac1基因小麦再生植株
• 6.1.3 转基因植株对BYDV抗性的剂量效应
• 6.1.4 正反向双启动子dsRNA双元表达载体构建
• 6.2 展望
• 6.2.1 转基因植株后代的抗性遗传分析
• 6.2.2 BYDV-GPV的沉默抑制蛋白分析
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历