论文摘要
目的:子宫颈癌是危害妇女生命健康的常见恶性肿瘤之一。全球每年约有46.6万例宫颈癌的新发病例,其中80%发生在发展中国家,它已成为发展中国家妇女死亡的主要的原因,死亡率仅次于乳腺癌,居于第二位。因宫颈癌筛查的全面开展,其发病率大大降低,但年轻妇女宫颈癌发病率有所增加。子宫颈癌的发生是涉及多种因素、多个步骤的病理过程。过去几十年里,人们从实验室到临床等不同方面进行了各种研究,但其发病机制尚未完全明了。p16基因又称多肿瘤抑制基因（multiple tumor suppressor, MTS1）它是人们发现的第一个直接作用于细胞周期,抑制细胞分裂的基因,其在宫颈癌的发生过程中起到何种作用,已成为研究的热点。许多研究证实,在子宫颈癌发生过程中存在p16蛋白表达异常,但其表达是升高,还是降低说法不一。p16基因在子宫颈癌的发生过程中其失活的机制究竟是什么,作为在宫颈癌研究中最受人关注的抑癌基因之一,p16与宫颈癌发生之间的关系还存在许多疑问。郑氏植物蛋白（Zheng’s plant protein, ZPP）是一种从低等植物中提取的糖蛋白,具有刺激肿瘤细胞增殖的作用,研究表明它是一种与人肿瘤抗原相关的植物蛋白。郑氏植物蛋白片段（Zheng’s plant protein segment, ZPPS）是邹岳奇等人经过进一步对ZPP结构以及相关基因的研究,对其继续提纯而制成。已有研究表明经131I标记的ZPPS在小鼠恶性肿瘤放射性核素显像中的摄取明显高于正常组织,且表达速度及程度均高于131I标记的ZPP。但ZPPS在宫颈癌组织中表达情况,还未见研究报道。本课题采用组织芯片、原位杂交及免疫组化技术研究抑癌基因p16 mRNA、P16蛋白及ZPPS在宫颈不同程度病变组织中的表达情况。探讨p16 mRNA与宫颈不同程度病变生物学行为的关系,探讨p16 mRNA的异常表达在宫颈癌的发生发展中的作用,探讨p16在蛋白水平和基因水平的表达是否相符及其在正常宫颈组织向CIN和宫颈癌发生、发展中的作用。这对于了解肿瘤的发病机制,提高宫颈肿瘤的诊断率有重要意义。方法:1收集研究样本宫颈组织共247例,其中宫颈鳞癌54例, CIN组织154例,正常宫颈组织39例。2应用自制组织芯片技术将247例供体标本,按阵列设计顺序依次放入受体蜡块中,融合、切片、捞片、烤片制成需要的组织芯片。3应用免疫组织化学技术（SP法）测定宫颈鳞癌、CIN组织及正常宫颈鳞状上皮组织中ZPPS及P16INK4A的表达。4采用原位杂交技术检测p16 mRNA在宫颈鳞癌、CIN组织及正常宫颈鳞状上皮组织中的表达情况。5采用SPSS11.5统计软件进行统计学处理,以α=0.05为检验水准,当P<0.05时具有统计学差异。结果:1组织芯片制备按课题需要制作6×5,7×5芯片共8张,组织点阵排列整齐,无点阵移位现象,有8个位点缺失,39个位点组织无意义,其他位点均可见足够的组织结构。组织位点的形态可观测率在83.3%～93.3%之间。HE染色均匀,无脱片、异位和皱折。免疫组织化学染色及原位杂交,阳性定位清楚,背景干净,无掉片现象。2 P16INK4A在子宫颈上皮不同病变中的表达采用免疫组织化学方法检测48例宫颈鳞癌、119例CIN,33例正常宫颈鳞状上皮中P16INK4A的表达。结果显示,正常宫颈鳞状上皮中P16INK4A无表达或仅在基底层部分细胞弱阳性表达。在CIN和宫颈鳞癌病例中,无论是基底层还是其他病变各层均可见细胞强阳性表达,宫颈鳞癌（93.75%）及各级别CIN（CINⅢ81.25%, CINⅡ64.10%, CINⅠ18.75%）均明显高于正常宫颈鳞状上皮（0%）中p16表达,差异具有显著性（p<0.01）;P16INK4A过表达在宫颈鳞癌中明显高于CINⅠ和CINⅡ（p<0.01） ;宫颈癌和CINⅢ之间差异无显著性（p>0.05）。其他各级别CIN之间P16INK4A的表达差异均有显著性（p<0.05）,且随级别增加表达增强。3 ZPPS在宫颈上皮不同病变中的表达采用免疫组织化学方法检测48例宫颈鳞癌、119例宫颈CIN及33例正常宫颈鳞状上皮组织中ZPPS的表达。在正常宫颈鳞状上皮中,ZPPS不表达或少量表达,从正常宫颈鳞状上皮（0%）、CINⅠ（6.25%）、CINⅡ（51.28%）、CINⅢ（58.33%）到宫颈鳞癌（72.92%）,ZPPS表达阳性细胞逐渐增多。ZPPS表达在正常宫颈上皮和CINⅠ中差异无显著性（p>0.05）;ZPPS在宫颈鳞癌及CINⅡ、CINⅢ中均高于正常宫颈鳞状上皮表达,差异具有显著性（p<0.05）;CINⅠ与正常宫颈鳞状上皮中ZPPS表达差异无显著性（p>0.05）。宫颈鳞癌与CINⅠ、CINⅡ均差异有显著性（p<0.05）,随级别增加表达增强,但与CINⅢ之间差异无显著性（p>0.05）。4 p16 mRNA在宫颈上皮不同病变中的表达采用原位杂交技术检测p16 mRNA在48例宫颈鳞癌、119例CIN（包括48例CINⅢ,39例CINⅡ,32例CINⅠ）及33例正常宫颈鳞状上皮组织中的表达。从正常宫颈鳞状上皮、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ到宫颈鳞癌,p16 mRNA的表达情况依次为18.18% （6/27）、43.75%（14/32）、56.41%（22/39）、75%（36/48）及79.17%（38/48）,差异具有显著性（p<0.01）。p16 mRNA阳性率在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈鳞癌中明显高于正常宫颈鳞状上皮（p<0.01）;宫颈鳞癌与CINⅠ及CINⅡ之间p16 mRNA阳性率差异具有显著性（p<0.01）。但在宫颈鳞癌和CINⅢ之间p16 mRNA表达差异无显著性（p>0.05）。5子宫颈鳞癌中p16 mRNA表达与ZPPS、P16INK4A表达的相关性分析在子宫颈鳞癌中p16 mRNA与P16INK4A表达具有显著正相关性（p<0.05,r=0.503）;p16 mRNA与ZPPS表达具有显著正相关性（p<0.05,r=0.380）;P16INK4A与ZPPS表达具有正相关性（p<0.05,r=0.402）。6子宫颈鳞癌中p16 mRNA、P16INK4A、ZPPS表达与年龄、肿瘤大小、分化程度、临床分期、淋巴结转移情况及病理分级之间的关系p16mRNA、P16INK4A与临床分期有显著相关性（p<0.05）,与年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移情况及病理分级之间均无明显相关性（p>0.05）。ZPPS表达与年龄、肿瘤大小、分化程度、病理分级之间均无明显相关性（p>0.05）,与淋巴结转移之间有显著相关性（p<0.05）。结论:1免疫组化方法标记P16INK4A的表达率从正常宫颈鳞状上皮、CIN到子宫颈鳞癌逐渐增高。2原位杂交检测p16 mRNA在正常宫颈组织中可见表达,并且随CIN级别升高到子宫颈鳞癌,p16 mRNA检出率逐渐增高。3子宫颈鳞癌中P16INK4A和p16 mRNA有正相关,说明p16基因在蛋白水平和mRNA水平是相符的。4免疫组化方法标记ZPPS的表达率从正常宫颈鳞状上皮、CIN到子宫颈鳞癌逐渐增高。5子宫颈鳞癌中P16INK4A过表达与ZPPS异常表达相关,二者呈正相关。提示两种蛋白的异常表达在宫颈癌的诊断过程中有协同作用,在诊断宫颈癌时可以同时进行检测。6 p16过表达与临床分期有显著相关性,与其他各临床病理因素之间均不存在相关性。ZPPS异常表达与淋巴结转移有显著相关性。p16 mRNA与临床分期有相关性。7组织芯片手工制做,程序简单、经济方便,是一种简便可行,高效稳定的技术方法,能满足相关科研课题和实际工作的需要。