HCV慢性感染患者病毒基因型、NS3区耐药相关变异和细胞毒T淋巴细胞表位变异的分析

论文摘要

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）具有相当高的变异性,HCV感染后多数可发展为慢性丙型肝炎,部分患者可进一步发展为肝硬化和肝癌。HCV基因型可以明显影响α干扰素抗病毒治疗的疗效,其中1型与2型HCV感染相比应答率较低。NS3蛋白是一种多功能蛋白,在病毒的生命周期中起重要作用,因而成为新型抗HCV药物的最主要的靶点。NS3蛋白同时也是细胞毒T淋巴细胞（CTL）的识别靶位。目前我国北方地区缺少近期大样本HCV基因分型资料,我国患者中HCV NS3区相关耐药变异和CTL表位变异尚未见报道。本文在对767例北方地区基因型的分析和150例HCV NS3蛋白激酶编码区序列分析,以了解我国北方地区HCV感染患者中近期HCV基因型流行状况以及蛋白酶抑制剂的天然耐药相关变异和CTL表位变异状况。目的（1）对北方地区慢性HCV感染患者的基因型进行分析,以进一步了解我国北方地区近期HCV基因型流行特点。（2）建立扩增和检测我国各种基因型HCV感染患者NS3蛋白激酶编码区序列扩增分析的方法。（3）对NS3区进行序列分析,揭示我国北方地区HCV感染患者中与NS3蛋白酶抑制剂相关耐药变异和CTL变位变异的特点。材料与方法（1）收集767例患者血清样本,其中慢性丙型肝炎患者518例,慢性丙型肝炎合并肝硬化213例,慢性丙型肝炎合并肝细胞癌36例。用基因芯片法进行HCV基因分型。（2）采用自行设计的型特异性引物介导巢式反转录多聚酶链反应（RT-PCR）,对其中150例各种基因型HCV感染患者的NS3区序列进行了PCR产物直接测序分析,部分样本进行了克隆测序分析;通过进化树分析确定HCV基因型,并与基因芯片法测得的基因分型结果进行了比较;分析了NS3区中与蛋白酶抑制剂teleprovir相关耐药位点的变异。（3）采用PCR法对NS3测序患者中的114例进行了HLA-A2,A11,A24和A33分型,并对已知A2和A24限制性NS3区CTL的表位变异情况进行了分析。结果（1）北方地区767例慢性HCV感染患者的基因分型结果为:1b占59.71%,2a占30.90%,1b/2a混合感染占3.26%,6型占2.49%,3a占1.56%,3b占0.91%,1b/3a混合感染占0.52%,2a/3a混合感染占0.26%,1a占0.26%,1a/1b占0.13%。不同诊断的慢性HCV感染者间的基因型分布无显著差异。（2）建立了NS3基因扩增方法可以有效扩增各基因型HCV的NS3片段,用NS3测序的150例患者样本中, 1b占66.7%（100/150）,2a占22.7%（34/150）,3a占4%（6/150）,3b占4%（6/150）,6型占2%（3/150）,1a占0.7%（1/150）,与基因芯片法分型结果有较高的符合率,进化树分析未见NS3序列有地区性聚集倾向。未检出与新型HCV蛋白酶抑制剂telaprevir耐药相关的V36M/A,T54A,R155K/T和A/156V/T变异。（3）HLA分型显示,114例患者样本中检出A2阳性43例,占37.7%,A11阳性44例,占38.6%,A24阳性27例,占23.7%,A33阳性16例,占14.3%。未检出上述4种型别的有13例,占11.4%。通过对表位A2和A24的变异分析表明,在HCVNS3区A2（CINGVCWTV）/（LLCPSGHAN）和A24（AYSQQTRGL）表位均存在明显的变异情况,并且多数变异表位中有多个氨基酸发生了替换。结论（1）在我国北方地区以1b型HCV感染最为常见, 2a型HCV感染次之。（2）我们建立的方法可以有效扩增各个HCV基因型的NS3蛋白酶编码基因,使NS3序列分析法可同时进行基因分型和蛋白酶抑制剂耐药变异检测。（3）我国慢性HCV感染患者中对telaprevir产生病毒自然变异引起的原发耐药可能性很小。（4）NS3区CTL表位的高度变异可能是HCV慢性化的机制之一。

论文目录

• ABBREVIATIONS
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 第二章 北方地区的样本767 例的基因型（芯片法测定）
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三章 150 例慢性HCV感染患者HCVNS3 序列的分析
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第四章 NS3 区CTL表位变异的分析
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢
• 攻读学位期间发表文章