野西瓜季铵碱线粒体途径诱导HepG-2细胞凋亡的研究

论文摘要

本文研究了野西瓜季铵碱对体外培养的人肝癌HepG-2细胞的生长抑制作用,并初步探讨了膜电位,PT孔道,以及CytoC,Bcl-2,Bax等相关蛋白与野西瓜季铵碱线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡的关系。MTT法测得其在体外的半数抑制浓度ICso为178.87μg/ml,并且这种抑制作用具有剂量依赖性。从SRB结果可看出,野西瓜季铵碱通过抑制肿瘤细胞生长而起抗癌作用,低浓度的野西瓜季铵碱通过抑制肿瘤细胞生长而起抗癌作用,GIso为35.93μg/mL,而高浓度的野西瓜季铵碱则主要通过杀死癌细胞来起到抗肿瘤作用,TGI50为127.12μg/ml,以上结果均表明野西瓜季铵碱对HepG-2细胞的生长具有抑制作用。在以上实验基础上,我们考察了野西瓜季铵碱诱导HepG-2细胞凋亡的途径。实验采用流式细胞仪,激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡线粒体途径中的几个关键事件。激光共聚焦显微镜检测结果表明,不同浓度的野西瓜季铵碱作用HepG-2细胞48 h后,PT孔道打开,且具有剂量依赖性。流式细胞仪结果表明,线粒体跨膜电位降低；流式细胞仪测定胞浆中细胞色素C浓度增加,同时caspase-9, caspase-3的活性均升高,以上结果表明,野西瓜季铵碱是通过启动线粒体途径而诱导HepG-2细胞发生凋亡的。酶标仪检测结果表明,100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的野西瓜季铵碱作用HepG-2细胞48h后Caspase-9和Caspase-3活性均升高,且随着野西瓜季铵碱浓度的增加而升高。流式细胞仪检测结果显示,100mg·L-1、200mg·L-1、400mg·L-1的野西瓜季铵碱作用HepG-2细胞48h后Bcl-2蛋白表达减弱而bax蛋白表达增强；作用48h后的Cty-c蛋白表达均增强。以上结果表明,野西瓜季铵碱诱导肿瘤细胞凋亡的途径为线粒体途径：首先通过上调Bax蛋白的表达,使Bax转移到线粒体后,破坏线粒体膜的稳定性,引起线粒体释放细胞色素c至胞浆,与Apaf-1结合,并活化上游的启动Caspase—Caspase-9,进而激活下游的效应Caspase—Caspase-3,引发Caspases级联反应,从而诱发细胞凋亡。另外野西瓜季铵碱还可通过下调Bcl-2蛋白的表达减弱了Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡的作用。综上所述,本课题通过体外实验证明了野西瓜季铵碱对人肝癌HepG-2细胞具有抗肿瘤活性。其作用机制可能是通过调节Bcl-2家族蛋白（上调Bax蛋白,下调Bcl-2蛋白）引起细胞线粒体PT孔开放,线粒体膜电位降低而释放细胞色素C,继而激活Caspase-3,引发Caspases级联反应,导致细胞凋亡

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 肝细胞癌发病分子机制的研究现状
• 1.1.1 发病因素
• 1.1.2 发病机理
• 1.1.3 抑癌基因的异常表达
• 1.1.4 特殊蛋白的表达
• 1.1.5 其他
• 1.2 细胞凋亡的调控
• 1.2.1 细胞凋亡的概念
• 1.2.2 线粒体在细胞凋亡中的作用
• 1.2.3 Caspase诱导细胞凋亡的机制
• 1.2.4 细胞色素c引起细胞凋亡的机制
• 1.2.5 胞内氧化还原电势的改变引起细胞凋亡
• 1.2.6 Bcl-2家族蛋白与凋亡调控
• 1.3 野西瓜的研究概况
• 1.3.1 野西瓜化学成分的研究
• 1.3.2 野西瓜的药理作用
• 1.3.3 野西瓜的临床应用
• 1.4 本课题来源及研究的意义
• 1.5 论文的研究内容
• 2 野西瓜季铵碱体外抗肿瘤作用研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 MTT法检测野西瓜季铵碱对HepG-2细胞增殖的影响
• 2.3.2 SRB法检测野西瓜季铵碱对HepG-2细胞增殖的影响
• 2.4 本章小结
• 3 野西瓜季铵碱线粒体途径诱导HepG-2细胞凋亡的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 野西瓜季铵碱对HepG-2细胞MPTP孔道开放的影响
• 3.3.2 野西瓜季铵碱对线粒体膜电位变化的影响
• 3.3.3 野西瓜季铵碱对HepG-2细胞胞浆中Cytochrome C蛋白表达的影响
• 3.3.4 野西瓜季铵碱对凋亡相关酶Caspase-9和Caspase-3活性的影响
• 3.4 本章小节
• 4 野西瓜季铵碱对Bax/Bcl-2的影响
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 野西瓜季铵碱对HepG-2细胞Bcl-2表达的影响
• 4.3.2 野西瓜季铵碱对HepG-2细胞Bax表达的影响
• 4.4 本章小结
• 5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 附录