论文摘要
耳聋在人群中有很高的发病率。近几年，遗传性耳聋研究飞速的发展。目前已经发现了很多的耳聋相关基因，这些研究成果使得破解听觉基因，诠释听觉系统的分子机制成为可能。但是，有时由于缺少临床特性，耳聋遗传异质性及家系比较小等原因，很难完全鉴别出相关基因。此外，某些相关基因由于缺少合适的家系进行连锁分析，也使得发现重要基因很困难。小鼠的内耳结构，发育及导致听力损失的病理学改变与人类极为相似。因此，小鼠耳聋相关性基因研究提供了另一种方法来鉴定出可能的耳聋基因座。Smad4、Smad5基因是参与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族信号下游的细胞质内信号转导分子，主要介导BMP4的信号。早前的研究证实，TGF-β家族成员在动物体内广泛参与调节各胚层的发育、器官的形成、上皮组织的增生、细胞外基质的合成、免疫反应等多种生物学过程。已研究表明，BMP信号分子家族成员及他们的信号转导分子在鸡、小鼠、斑马鱼和非洲蟾蜍的内耳发育中均有表达，本课题组发现Smad4、Smad5基因剔除导致小鼠严重听力障碍，而且内耳听觉器官包括毛细胞、支持细胞和螺旋神经节等出现不同程度的损害，表明，Smad4、Smad5基因可能是听功能相关基因。但是，Smad4、Smad5基因对内耳胚胎具体作用部位、作用时间及作用机制，尚未见报道。因此本研究对小鼠内耳听觉器官发育过程进行了动态观察，对小鼠内耳听觉器官发育形态进行了观察，并且初步比较了常用两种品系小鼠发育的异同点，通过毛细胞特异性标记物MyosinⅥ进一步观察毛细胞发育过程。利用免疫组化方法对BMP4、Smad4、Smad5基因在内耳发育中可能的信号传导机制进行了探讨。第一部分：小鼠内耳听觉器官发育过程研究目的研究国内最常用两种品系小鼠内耳听觉器官发育演变过程，为研究内耳发育选择合适品系小鼠提供依据。方法：选用耳廓反应灵敏、健康的C57BL／6小鼠和昆明白种小鼠分别作为种鼠交配，用观察阴栓方法获得适龄胎鼠，≤18天取胚胎头，≥19天在显微镜下取耳蜗，胚胎头水平冰冻切片，耳蜗平行于蜗轴冰冻切片，HE染色方法观察小鼠耳蜗发育形态演变过程。应用MyosinⅥ免疫荧光化学方法标记毛细胞。结果：昆明白种小鼠和C57BL／6小鼠内耳发育过程基本相似，但昆明白种小鼠的内耳发育时间比C57BL／6小鼠晚一天。HE染色观察C57BL／6小鼠，胚胎第10天，听泡发育，胚胎12天听泡下部有蜗管始基形成并开始发育。胚胎第17天，蜗管基底部外侧形成可辨认的毛细胞，耳蜗底转未来形成Corti隧道的部位变的比较明显，并且血管纹开始分化。小鼠刚出生时底转的Corti器形态已接近成熟，基底膜仍较厚，Corti器隧道尚未形成，血管纹已发育。出生后第8天，Corti隧道变宽。出生后第10天，Nuel间隙形成，耳蜗形态发育基本成熟。MyosinⅥ免疫荧光从胚胎17天开始在毛细胞阳性表达。结论：内耳听觉器官发育具有一定的规律，昆明白种小鼠和C57BL／6小鼠内耳发育过程基本相似，但昆明白种小鼠的内耳发育时间晚一天。近交系小鼠基因型更纯合一致，故第二部分实验动物选择C57BL／6小鼠。第二部分Smad4／Smad5基因在小鼠内耳听觉器官发育中的信号调控作用目的：研究Smad4／Smad5基因在小鼠内耳耳蜗发育过程中的作用及可能的作用机制以及与BMP4的关系。方法：选用耳廓反应灵敏、健康的C57BL／6小鼠作为种鼠交配，用观察阴栓方法获得胚胎9天到20天的胎鼠，≤18天取胚胎头，≥19天在显微镜下取耳蜗，胚胎头水平冰冻切片，耳蜗平行于蜗轴冰冻切片，HE染色方法观察小鼠内耳发育形态演变过程，免疫组织化学方法检测Smad4、Smad5、BMP4基因蛋白在小鼠胚胎第10天到出生后14天的表达情况。结果：BMP4和Smad5在小鼠内耳听觉器官的整个发育过程中均有表达。表达的部位及表达程度基本一致，在听囊期，表达遍及整个听囊上皮。内耳听觉器官胚胎分化及成熟初期表达主要集中在将发育成感觉细胞及支持细胞的部分；耳蜗胚胎发育成熟期开始，表达明显，在内耳耳蜗均有表达，主要表达在内外毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹、基底膜、前庭膜等，骨蜗管及蜗轴的表达最为强烈。到出生时，耳蜗大体结构发育基本形成，前庭膜、盖膜、血管纹及基底膜上结构包括毛细胞在内亦均见表达。Smad4的表达在时间上与BMP4和Smad5有所不同，小鼠胚胎期听泡发育及耳蜗蜗管增殖期未见阳性表达，胚胎15天开始，空间表达部位与BMP4和Smad5基本相同。Smad5、Smad4和BMP4在内耳听觉器官胚胎发育中后期，胚胎14天细胞开始分化以后，在时间、空间的表达基本一致。结论：BMP4、Smad4、Smad5基因均参与小鼠耳蜗胚胎发育过程，为听觉的发生所必需。＞E14可能存在BMP4配体刺激使BMP Ⅰ型和Ⅱ型受体形成受体复合物，受体激活Smad5，Smad5与Smad4结合进入细胞核信号传导通路，从而调控内耳听觉器官发育。≤E14，BMP4-Smad5通路可能不需要Smad4参与即可发挥其作用，推断存在另外一种因子促进BMP4-Smad5通路转录启动。