论文摘要
子宫珠蛋白（uteroglobin,UG）是一种具有多种生物活性的小分子分泌性蛋白。在呼吸系统,UG主要由衬覆于远端细支气管的非纤毛上皮细胞Clara细胞所分泌,因此也称为Clara细胞分泌蛋白（Clara cell secretoryprotein,CCSP）、Clara细胞蛋白10（CC10）等。UG新近被正式确定为分泌珠蛋白家族成员1A1（secretoglobin,family 1A,member 1,SCGB1A1）。UG最早在兔的子宫内膜发现并由此命名,研究显示,子宫、胸腺、垂体、肺、胃肠道、胰腺、乳腺、前列腺等多种组织均可表达UG,但以肺和支气管的表达水平最高,其在肺内的表达强度可比前列腺、子宫内膜等组织高20倍。UG具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抑制肿瘤细胞外基质侵袭、抑制成纤维细胞趋化、抑制TH2细胞活化等多种生物活性。UG作为肺内源性保护因子已经日益受到重视,并有望成为某些疾病治疗的有效手段。Antiflammins（简称AFs）是与UG的第三个α螺旋中的保守序列以及脂皮素序列中的某些保守序列高度同源的一类寡肽的统称,由于最初发现在体内具有强的抗炎作用而命名。其中,Antiflammin-1（简称AF-1）对应于UG分子中第39-47位的氨基酸（MQMKKVLDS）,由疏水氨基酸残基组成,其C端的氨基酸残基Lys和Asp分别对应于UG的第43位Lys和第46位Asp。AF-1具有强的抗炎及抑制黏附等多种与UG全长蛋白相似的生物活性。与大分子天然蛋白相比,活性寡肽分子量更小,具有更低免疫原性和潜在的应用前景。肺纤维化是严重危害健康的呼吸系统常见并发症,是多种病因不同的肺间质疾病的最后共同结局。肺纤维化的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势,五年存活率不足50%。肺纤维化的发病机制远未阐明,至今仍无特效的治疗方法,目前多种抗肺纤维化的治疗并未能有效地改善其不良预后。探讨新的肺纤维化治疗的途径,是肺纤维化研究的活跃领域。目前对肺纤维化发生的研究,主要集中在促纤维化机制的研究,对肺纤维化负性调控机制的研究较少。本室研究曾首次证实肺内分泌UG的Clara细胞具有抗肺纤维化的效应,提示了UG对肺纤维化进程的负性调控作用。随后有研究表明,UG基因敲除小鼠更易发展成为肺纤维化,进一步提示了UG的抗肺纤维化效应。UG可能是肺内天然存在的肺纤维化负性调控因子。但目前UG及其活性片段生物学作用的机制还远未阐明。UG的生物学作用可能有赖于子宫珠蛋白结合蛋白（UG结合蛋白,Uteroglobin-binding protein,UGBP）的介导,但目前对UGBP的基因结构和生物学功能还了解甚少。Kundu等曾用Affinity cross-linking方法在小鼠成纤维细胞NIH3T3和某些鼠的癌细胞上先后发现了两种UG的结合蛋白。DiazGonzalez和Nieto等通过Gel filtration也发现过另外可以结合UG的蛋白质。然而,由于这些结合蛋白在当时均未被克隆和鉴定,这些表观分子大小不同的蛋白究竟属于同一种蛋白的不同亚基或者多聚体还是完全不同的蛋白质并不清楚,它们之间的关系也不明确。小鼠的UG结合蛋白（uteroglobin-binding protein,UGBP,也称UG受体,uteroglobin receptor）基因于2001年克隆。生物信息学分析显示UGBP可能是具有9次跨膜结构的膜蛋白。目前,国内外对UGBP的基因结构和生物学功能了解甚少,对其研究均远远滞后于对其天然配体UG的研究,这将限制对UG生物学功能的全面深入的认识,也必将限制其可能的临床应用。因此,针对目前UG结合蛋白研究滞后这一现状而进行探索性研究具有重要意义。由于Antiflammin-1（AF-1）是源于UG的C端保守序列的寡肽,对应于UG的第3个α螺旋的第39-47位氨基酸序列,具有与UG全长蛋白相似的生物活性,文献报道,第3个α螺旋是UG与其他蛋白相互作用的部位,因此,研究AF-1与UGBP的相互作用及意义十分必要。探讨UGBP与其配体的相互作用的特点及意义,将有助于进一步阐明UG及其活性片段生物学作用的机制,并为UG及衍生物可能的临床应用提供理论依据。本文共分为四章。在对小鼠UG结合蛋白（mUGBP）进行生物信息学分析预测的基础上,本研究对mUGBP的亚细胞定位、UG的C端寡肽AF-1与mUGBP蛋白在活细胞上的结合特性、对小鼠成纤维细胞内ERK1/2磷酸化的影响,以及生物学意义等方面进行了初步探讨。主要研究结果如下:1.利用RT-PCR方法进行了mUGBP cDNA的克隆,将mUGBP cDNA克隆至真核表达载体pEGFP-N1,构建了增强型绿色荧光蛋白与小鼠UG结合蛋白——mUGBP的融合表达载体pUGBP-EGFP。用GFP标签技术对mUGBP蛋白在COS-1细胞中的定位进行了研究。同时,本研究制备了兔抗mUGBP蛋白的多克隆抗体,用制备的mUGBP抗体对已经证实的有mUGBP基因表达的小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞进行亚组分Western blot分析和免疫荧光检测发现,mUGBP蛋白主要在细胞质膜组分中表达。2.在本文第二部分的研究中,用荧光染料Cy5标记了AF-1,与克隆至绿色荧光载体的mUGBP蛋白在COS-1细胞中进行了共定位研究。在培养条件下直接用激光共聚焦镜观察发现,mUGBP与EGFP融合蛋白的表达和Cy5-AF-1呈完全共定位关系,提示了AF-1与mUGBP在活细胞上可相互结合的性质;进而,用荧光染料Cy5标记的寡肽AF-1作为探针,用流式细胞分析方法检测了AF-1与mUGBP阳性表达细胞——小鼠成纤维细胞NIH3T3之间的结合,在完整细胞上进行的FACS配体结合分析实验结果表明,AF-1与NIH3T3细胞之间的结合具有竞争抑制的特征。AF-1与mUGBP阳性表达细胞NIH3T3结合的Kd值在29.19～46.33nM之间,具有较高亲和力。Scatchard作图呈线性,结合符合简单位点系统的特征。AF-1与mUGBP具有相互结合特性的初步明确,为进一步探讨二者相互作用的意义及对细胞功能的影响奠定了基础。3.本研究的第三部分探讨了AF-1对成纤维细胞NIH 3T3细胞内ERK1/2磷酸化的影响,并以磷酸化ERK1/2蛋白表达水平的改变作为AF-1与mUGBP相互作用后的一种的细胞效应,检测了mUGBP蛋白表达水平与ERK1/2磷酸化水平之间的关系。研究结果表明,AF-1可以增加mUGBP阳性表达的NIH3T3细胞内磷酸化ERK1/2蛋白的表达水平,剂量依赖关系及时间依赖关系明显。AF-1可以同时激活ERK1和ERK2,但在同样的条件下p42 MAPK（ERK2）可以被更多更有效地激活。构建并筛选到有效抑制mUGBP表达的shRNA真核表达载体,观察了用pShUGBP敲减mUGBP表达后对NIH3T3细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达水平的影响,发现瞬时转染pShUGBP的NIH3T3细胞磷酸化ERK1/2蛋白的表达水平明显低于对照组细胞,首次提示了mUGBP与AF-1介导的小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞内ERK磷酸化改变之间的关联。此外,用Real time PCR array方法在小鼠成纤维细胞NIH3T3上筛选到敲减mUGBP基因表达后Mdm2、Egr1、Fos等差异表达的信号通路分子,为揭示mUGBP相关的信号通路和进一步的功能研究提供了启示。4.本文的第四部分研究了mUGBP在小鼠肺纤维化模型肺组织内的表达变化特点,首次发现mUGBP在正常与肺纤维化肺组织之间存在表达差异。但是,mUGBP在肺纤维化时表达上调和分布不均一特点的生物学意义目前还不明确。在小鼠成纤维细胞系NIH 3T3上的初步研究结果表明,AF-1对TGF-β1诱导的成纤维细胞胶原表达的抑制效应与mUGBP的表达水平关系密切,提示mUGBP表达水平可能与不同条件下细胞对配体反应性不同相关,但相关机制还有待进一步研究证实。结论:①mUGBP蛋白主要定位于细胞质膜上;②UG活性片段AF-1可与完整活细胞上mUGBP特异性结合,其结合符合简单位点系统的特征,可被竞争抑制,Kd值在29.19～46.33nM之间,具有较高亲和力;③AF-1通过mUGBP的介导可影响小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞内ERK磷酸化水平:④mUGBP在正常与肺纤维化肺组织之间存在表达差异。AF-1对TGF-β1诱导的成纤维细胞胶原表达的抑制效应与mUGBP的表达水平关系密切。以上研究结果首次表明,小鼠UG结合蛋白（mUGBP）主要在质膜表达,UG活性片段AF-1在完整活细胞上与mUGBP特异结合,并引起信号通路分子ERK1/2磷酸化水平的改变。上述结论进一步支持UGBP作为AF-1功能受体的假说,相关机制和功能意义值得进一步研究探讨。mUGBP在正常与肺纤维化肺组织之间存在表达差异的现象,则为进一步展开UGBP的相关功能研究提供启示。
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标签：子宫珠蛋白论文; 细胞分泌蛋白论文; 子宫珠蛋白结合蛋白论文; 抗炎素论文; 肺纤维化论文;